Summary
इस पत्र में, हम एक ठेठ को अलग और संस्कृति वयस्क चूहे दिल myocytes वर्णित है. Collagenase और protease को पचाने के लिए और एक myocytes अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है. Myocytes सुसंस्कृत सबसे अधिक प्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें.
Abstract
संवर्धित प्राथमिक वयस्क कृंतक हृदय कोशिकाओं हृदय अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रहे हैं. फिर भी, मजबूत, व्यवहार्य सुसंस्कृत वयस्क myocytes की स्थापना के एक तकनीकी चुनौतीपूर्ण, कई शोधकर्ताओं के लिए कदम दर को सीमित किया जा सकता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल वर्णित वयस्क चूहे दिल myocytes कि संस्कृति में कई दिनों के लिए व्यवहार्य रहने का एक उच्च उपज प्राप्त की. दिल और अलग है कम Ca के तहत collagenase और protease साथ perfused
Protocol
पार्ट सर्जरी के लिए मैं तैयार
- चूहा सर्जरी से पहले दिन, निश्चित है कि सभी समाधान बना रहे हैं, लेकिन अभी तक नहीं जोड़ किसी भी एंजाइमों. Buffers ए, बी और धोने बफर सभी बाँझपन के लिए फ़िल्टर किया जाना चाहिए भंडारण के लिए पहले. बफ़र्स सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाना चाहिए
- 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें 10-20 μg / एमएल 2 एमएल 1XSFM में के रूप में अच्छी तरह से पहले दिन laminin के साथ चढ़ाया जाना चाहिए, और 37 ° सी सीओ 2 इनक्यूबेटर में संग्रहित किया जाना चाहिए .
- सर्जरी के दिन पर, 70% इथेनॉल के साथ दबाना, कैंची और संदंश स्टरलाइज़ द्वारा शल्य चिकित्सा उपकरणों को तैयार करने और उन्हें कागज तौलिया पर सूखी.
- 0.5 एमएल हेपरिन समाधान (90 यू / एमएल) के साथ एक 1 एमएल भर सिरिंज तैयार किया है.
- अब यह 70% इथेनॉल के माध्यम से चल रहे हैं, रिवर्स में क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करके छिड़काव तंत्र धोने के लिए अच्छा अभ्यास है. एक बार जब इथेनॉल के साथ rinsing समाप्त, दोहरा आसुत जल के साथ तंत्र कुल्ला, और अंत में बफर ए के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा बीकर में एकत्र के माध्यम से प्रवाह कुल्ला.
- साफ छिड़काव तंत्र तैयार करने के लिए, एक बफर और बाएँ सिरिंज ट्यूब के 40 एमएल के साथ बफर बी के 40 एमएल के साथ सही सिरिंज ट्यूब भरने
- प्रधानमंत्री छिड़काव बफर एक तंत्र के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देता है कैथेटर की नोक पर टयूबिंग. बफर 40 एमएल स्तर के लिए एक सिरिंज के लिए फिर से भरना. सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई हवा बुलबुले के इस कदम के बाद टयूबिंग में फंस रहे हैं.
- अब, बफर एक सिरिंज पानी निकलने की टोंटी वाल्व बंद और बफर ऐसे बी के साथ इस प्रक्रिया को दोहराने कि छिड़काव टयूबिंग अब बफर बी के साथ primed है
- अंत में, छिड़काव तंत्र बफर बी पानी निकलने की टोंटी वाल्व खोलने के साथ छोड़ दिया है, लेकिन प्रवाह के साथ चतुर्थ लाइन पर नियामक का उपयोग बंद कर दिया.
- एकत्रित बीकर में बफर प्रवाह हालांकि त्यागें.
- पिछले सर्जरी से पहले बात अपने शेयर समाधान के लिए आवश्यक एंजाइमों को जोड़ने, और तब एंजाइम समाधान फ़िल्टर बस के रूप में अन्य समाधान दिन पहले फ़िल्टर्ड गया है. एक बार फ़िल्टर, इस समाधान के कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जा सकता है.
भाग द्वितीय. चूहा दिल विच्छेदन
- निम्नलिखित मानक प्रोटोकॉल के साथ एक गैस चेंबर में Isoflurane चूहे euthanize.
- 70% इथेनॉल के साथ छाती पर चीरा क्षेत्र जीवाणुरहित.
- ओपन सीने में कैंची का उपयोग करने और दिल को बेनकाब.
- 0.5 एमएल हेपरिन समाधान (90 यू / एमएल) के साथ बाएं वेंट्रिकल इंजेक्षन.
- बरकरार जगह, महाधमनी के बड़े हिस्से के साथ बर्फ के ठंडे बफर बी में दिल निकालें
भाग III. Myocytes अलगाव
- एक ठेठ चूहे दिल अगर निम्न कार्यविधि का ठीक से पालन किया है छड़ के आकार myocytes के एक उच्च अंश (के रूप में मृत कोशिकाओं को गोल करने के लिए विरोध) उपज चाहिए.
- शुरू करने के लिए, कैथेटर को महाधमनी दबाना. कैथेटर की नोक दिल में बहुत दूर धक्का नहीं किया जा कोरोनरी धमनी के माध्यम से दिल की अच्छी छिड़काव सुनिश्चित करना चाहिए.
- एक बार clamped, सिवनी के साथ कैथेटर महाधमनी टाई.
- अगला, चतुर्थ लाइन नियामक खोलने के लिए एक तेजी से ड्रिप दर (~ 60 बूँदें / मिनट) की अनुमति के लिए और बफर बी अनुमति देने के लिए बाहर दिल धो.
- बफर बी धोने के दौरान, छोटे कैंची और संदंश का उपयोग करने के लिए आलिंद और किसी भी वसा या फेफड़ों के दिल को पकड़ के ऊतकों को हटाने के लिए.
- बफर बी के बाद समाप्त हो गया है, बफर ए के प्रवाह स्विच
- जबकि बफर एक 5 मिनट के लिए प्रवाह करने की अनुमति दी है, कई छोटे कार्यों जल्दी से किया जाना चाहिए.
- सबसे पहले, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एनजाइम समाधान गर्म.
- अंत में, जब एक बफर सिरिंज से समाप्त हो गया है (लेकिन अभी भी टयूबिंग में मौजूद), सिरिंज में एनजाइम समाधान के 50 एमएल लोड छिड़काव तंत्र की एक
- अब यह संग्रह बीकर में पानी के स्नान (pipetting द्वारा) से प्रवाह के माध्यम से त्यागें आवश्यक एनजाइम समाधान perfuses दिल तक.
- जैसे ही के रूप में एनजाइम समाधान दिल perfuses, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप जो सेट है करने के लिए इकट्ठा बीकर से एंजाइम समाधान स्थानांतरण करने के लिए फिर से भरना सिरिंज ए सक्रिय
- एंजाइम समाधान के लिए 10 मिनट के लिए दिल के माध्यम से प्रवाह की अनुमति दें. के रूप में दिल हज़म, यह करने के लिए फूला हुआ देखो के लिए शुरू होता है.
- सिरिंज में एंजाइम समाधान के लिए 0.1 एम 2 CaCl के 37.5 μL जोड़ें करने के लिए 0.1 मिमी 2 Ca के एक प्रभावी एकाग्रता दे ए +.
- 10 मिनट के बाद 0.2 मिमी के लिए सिरिंज एक 0.1 एम 2 CaCl के एक अतिरिक्त 50 μL जोड़कर कैल्शियम की एकाग्रता और बढ़ाने के छिड़काव एक और आगे 10 मिनट के लिए आगे बढ़ना.
- बंद निलय काटें और एक छोटे से 20 एमएल एनजाइम समाधान युक्त बाँझ बीकर को हस्तांतरण.
- बीकर में 0.1 एम 2 CaCl के 40 μL अधिक जोड़कर 0.4 मिमी कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि .
- धीरे छोटे बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ 10 या अधिक टुकड़ों में दिल कीमा.
- 37 में 5 मिनट के लिए बीकर सेते डिग्री सेल्सियस कोमल कमाल के साथ.
- 0.1 एम 2 CaCl के 40 एमएल जोड़ें0.6 मिमी 2 + Ca के प्रभावी एकाग्रता दे और धीरे से एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet 3-5 बार के साथ दिल के टुकड़े को triturate.
- 37 पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए incubating के बाद डिग्री सेल्सियस, 0.1 एम 2 CaCl के 40 एमएल जोड़ने और धीरे के रूप में पहले से triturate.
- अलग पचा से एकल myocytes गैर पचा संयोजी ऊतक का उपयोग कर एक बाँझ 500 सुक्ष्ममापी जाल के माध्यम से छानने का काम है.
- कोशिकाओं को एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
- एक हस्तांतरण pipet के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- धीरे धो बफर # 1 में resuspend कोशिकाओं और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10-20 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
- जबकि कोशिकाओं व्यवस्थित कर रहे हैं, एक छोटे से विभाज्य ले, और एक औंधा माइक्रोस्कोप के अंतर्गत गुणवत्ता और निलंबन में कक्षों की व्यवहार्यता का आकलन करने का अवसर के रूप में इस समय का उपयोग करें. एक अच्छी तैयारी छड़ी के एक उच्च (> 80%) कुरकुरा striations के साथ कोशिकाओं की तरह अनुपात होगा.
- एक बार कोशिकाओं तय हो चुका है, धो बफर # 2 में सतह पर तैरनेवाला और धीरे resuspend कोशिकाओं त्यागें. कोशिकाओं कमरे के तापमान पर बसा, जो फिर से 10-20 मिनट लग चाहिए, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ धो बफर # 3, और कोशिकाओं के साथ एक बार संस्कृति के लिए तैयार हो जाएगा.
भाग IV. Myocyte सेल संस्कृति
- धीरे से 5% की सीरम मीडिया में कोशिकाओं resuspend. टिशू कल्चर प्लेटें कोशिकाओं स्थानांतरित करने से पहले, 1x SFM के साथ प्लेटें धोने. एक वांछित घनत्व और 3-5 घंटे के लिए सेते सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं का स्थानांतरण .
- 1x SFM मीडिया के स्विच.
- कोशिकाओं के लिए संवर्धित किया जा सकता है है चार दिन के लिए और प्रयोग किया जाता के रूप में प्रयोगों के लिए आवश्यक है.
पार्ट वी. प्रतिनिधि / परिणाम परिणाम
उल्टे खुर्दबीन के नीचे 70% से अधिक रहते हैं दिल myocytes जब प्रोटोकॉल सही ढंग से किया है किया जाना चाहिए.
तालिका 1: 1 एल के समाधान के लिए नुस्खा 10X 2 Ca + मुक्त के.एच. बफर :
| सामूहिक | अंतिम एकाग्रता | |
| NaCl | 68.96 छ | 1180 मिमी |
| KCl | 3.58 छ | 48 मिमी |
| HEPES | 59.58 छ | 250 मिमी |
| कश्मीर 2 HPO 4 | 2.85 छ | 12.5 मिमी |
| 4 MgSO | 3.08 छ | 12.5 मिमी |
तालिका 2: 1 एल एक बफर के समाधान के लिए नुस्खा :
100 एमएल 10X के.एच. बफर करने के लिए 1.98 ग्राम ग्लूकोज जोड़ें और 1 एल के अंतिम मात्रा करने के लिए लाने के निकट फिजियोलॉजी हालत (300 ~) को ग्लूकोज के साथ osmolarity समायोजित. NaOH के साथ 7.4 पीएच को ले आओ.
| - | सामूहिक | अंतिम एकाग्रता |
| 10X के.एच. बफर | 100 एमएल | 100 मिलीलीटर |
| ग्लूकोज़ | 1.98 छ | 11 मिमी |
| एल 1 लाओ | ||
| NaOH के साथ 7.4 पीएच लाओ | ||
| Osmolarity ग्लूकोज (300 ~) के साथ निकट शारीरिक हालत के लिए समायोजित करें. | ||
तालिका 3: एनजाइम Buffers समाधान के लिए नुस्खा
| सामूहिक | अंतिम एकाग्रता | |
| Collagenase प्रकार द्वितीय | 25 मिलीग्राम | 0.05% (w / v) |
| Protease XIV | 10 मिलीग्राम | 0.02% (w / v) |
| BDM | .025 छ | 5 मिमी |
| Carnitine | .020 छ | 2 मिमी |
| Taurine | .031 छ | 5 मिमी |
| Glutamic एसिड | .020 छ | 2 मिमी |
| 0.1 एम 2 CaCl | 12.5 उल | 25 उम |
| एक बफर | 50 मिलीलीटर भरें |
टेबल 4: 25x BDM / Taurine / BSA (बी / टी / बी) के समाधान के लिए नुस्खा
| सामूहिक | अंतिम एकाग्रता | |
| BDM | .076 छ | 125 मिमी |
| Taurine | .094 छ | 125 मिमी |
| BSA | 0.1% (w / v) | |
| एक बफर | एमएल 6 करने के लिए भरें |
तालिका 5: बफर बी और धो Buffers के लिए समाधान नुस्खा
| बफर: | बी | # 1 | # 2 | # 3 |
| जोड़ें: | ||||
| 0.5 एम 2 CaCl | 0.4 एमएल | 0.1 एमएल | 0.125 एमएल | 0.15 एमएल |
| 2 CaCl के अंतिम एकाग्रता | 1 मिमी | 1 मिमी | 1.25 मिमी | 1.5 मिमी |
| बी 25x / टी / बी | --- | 2 एमएल | 2 एमएल | 2 एमएल |
| एक को अंतिम मात्रा बफर | 200 एमएल | 50 एमएल | 50 एमएल | 50 एमएल |
तालिका 6: संवर्धन मीडिया के लिए समाधान नुस्खा
| 2X सीरम मुक्त मीडिया (SFM) | ||
| अंतिम एकाग्रता | ||
| (कमजोर पड़ने के बाद) | ||
| Carnitine | .099 छ | 10 मिमी (5 मिमी) |
| Taurine | .063 छ | 10 मिमी (5 मिमी) |
| Creatine | .075 छ | 10 मिमी (5 मिमी) |
| / एंटीबायोटिक Antimycotic | 0.5 मिलीलीटर | 1% (0.5%) (v / वी) |
| 199 मीडिया | 45 एमएल | 50 एमएल के लिए भरें |
| 1X SFM | ||
| अंतिम एकाग्रता | ||
| 2X SFM | 25 एमएल | 1X |
| 199 मीडिया | 50 एमएल के लिए भरें | |
| 1X 5% सीरम मीडिया | ||
| अंतिम एकाग्रता | ||
| 2X SFM | 25 एमएल | 1X |
| FBS | 2.5 एमएल | 5% (v / v) |
| 199 मीडिया | 50 एमएल के लिए भरें |
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Discussion
एक महत्वपूर्ण कदम की गति के साथ जो अलग दिल छिड़काव प्रणाली पर लटका दिया है. enzymatic पाचन की अवधि के एक छोटे से प्रत्येक चूहे के लिए अलग अलग लंबाई हो सकता है. समायोजन कैसे नरम दिल पाचन की नियमित अवधि के बाद हो जाता है पर निर्भर करता है. धीरे धीरे 2 Ca वसूली + के बाद एंजाइम पाचन प्राप्त करने Ca 2 + सहिष्णु स्वस्थ कोशिकाओं के लिए आवश्यक है.
गिनी पिग के लिए, प्रोटोकॉल ही है छोड़कर hyaluronidase बजाय Protease XIV की प्रयोग किया जाता है. आमतौर पर, हम पाते हैं कि जीवित कोशिकाओं के प्रारंभिक प्रतिशत चूहे के लिए तुलना में गिनी पिग के लिए कम है, हालांकि वे बस के रूप में लंबे समय संस्कृति में जीवित है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
