Beredning av Aplysia Sensomotorisk Neuronal cellkulturer

Summary

Primär kulturer

Abstract

Nervsystemet av den marina mollusk Aplysia californica är relativt enkel och består av cirka 20.000 nervceller. Nervceller är stora (upp till 1 mm i diameter) och identifierbara, med tydliga storlekar, former, positioner och pigmenteringar, och cellen kroppar är externt exponerade i fem parade ganglier distribueras i hela kroppen av djuret. Dessa egenskaper har gjort utredare för att avgränsa kretsen underliggande specifika beteenden i djuret ^1. Den monosynaptic sambandet mellan sensoriska och motoriska nervceller är en central del av gäl-tillbakadragande reflex hos djuret, en enkel defensiv reflex där djuret drar tillbaka sitt bottengarn som svar på taktil stimulering av sifon. Denna reflex genomgår former av icke-associativa och associativa inlärning, inklusive sensibilisering, tillvänjning och klassisk betingning. Av särskild nytta för studier av synaptisk plasticitet, kan sensomotorisk synaps beredas i kultur, där välkarakteriserad stimuli framkallar former av plasticitet som har direkt korrelerar i djurets beteende ^2,3. Specifikt producerar tillämpning av serotonin en synaptisk förstärkning som, beroende på Application Protocol, varar i minuter (på kort sikt underlätta), timmar (mellanliggande sikt underlätta) eller dagar (lång sikt underlätta). Däremot producerar tillämpning av peptiden sändaren FMRFamide en synaptisk försvagning eller depression som, beroende på applikation protokollet kan pågå från minuter till dagar (långvarig depression). Den stora storleken på nervceller möjliggör upprepade skarpa elektrod inspelning av synaptisk styrka under perioder av dagar tillsammans med mikroinjektion av expressionsvektorer, siRNA och andra föreningar för att inrikta sig på särskilda signalering kaskader och molekyler och därigenom identifiera de molekylära och cellbiologiska steg som ligger bakom de förändringar i synaptisk effekt.

En ytterligare fördel med Aplysia kultur-systemet kommer från det faktum att de nervceller visar synapsen-specificitet i kulturen ^4,5. Således utgör sensoriska neuron inte synapser med sig själva (autapses) eller med andra sensoriska nervceller, inte heller bildar synapser med icke-målorganismer identifierade motoriska nervceller i kultur. Den varicosities, platser av synaptiska kontakter mellan sensoriska och motoriska nervceller, är tillräckligt stora (2-7 mikrometer i diameter) så att synapserna bildas (samt förändringar i synaptiska morfologi) med nervceller målet motor som skall undersökas i ljuset mikroskopisk nivå.

I denna video visar vi varje steg för att förbereda sensomotorisk neuron kulturer, inklusive anesthetizing vuxna och unga Aplysia, dissekera deras ganglier, proteas nedbrytning av ganglier, borttagning av bindväv med microdissection, identifiering av både sensoriska och motoriska nervceller och borttagning av varje celltyp som microdissection till plätering av motorn neuron, tillägg av sensoriska neuron och manipulation av sensoriska neurite formen kontakt med den odlade motoriska neuron.

Protocol

Beredning (se lösningar avsnitt i slutet av protokoll för sammansättning av lösningar)

1. Förbered kultur rätter. Coat glas väl av Mattek glasbottnade kultur fat med poly-L-lysin (görs i natriumborat). Lägg tillräckligt för att helt täcka glaset väl och låt stå i> 1 timme (kan lämnas över natten). Noggrant bort poly-L-lysin genom att skölja i konstgjorda havsvatten (ASW) 4-5 gånger. Efter att den sista sköljningen, tillsätt 2 ml av 50% L15 (kompletteras med salter och som innehåller L-glutamin vid en slutlig koncentration av 2mm) / 50% hemolymph. Detta odlingsmedium måste vara i skålen i minst en timme före ytbehandling celler så att hemolymph rockar skålen.
2. Rengör verktyg och rätter Sylgard med etanol, skölj dem noga med DDH ₂ 0 och sedan placera dem i> 1 timme under en UV-ljus i kulturen huva.
3. Förbered skarpa elektroder för microdissection av nervceller. Med hjälp av en mikroelektrod avdragare (t.ex. Sutter Flaming Brun P-97), dra elektroder glaspipett med 1,5 mm ytterdiameter, från 0,86 till 1,12 mm innerdiameter och 100 mm längd (t.ex. PM-systemet på katalog # 628 tusen, World precisionsinstrument TW150-4, 1,55 / 1,12). Använd parametrar som ger en elektrod med en lång och stripig fin spets av så hög resistans att ingen kapillär intag av vätska när den placeras i lösning. Närvaron av en vätska menisk betyder att elektroden spetsen kommer att skada neuron under isolering. De Sutter elektrod kokbok ger utmärkt riktlinjer för inrättande elektrod program. Vi använder en låda glödtråd, och ett steg dra för att skapa kultur elektroder.
4. Förbered anestesi lösning (0,35 m MgCl2), odlingssubstrat (L15 kompletteras med salter och hemolymph) och proteas-lösning (1% proteas typ IX, Sigma, 1 enhet / mg, till en slutlig koncentration på 10 enheter / ml).
5. Djur: använd vuxna 80-100 g Aplysia för isolering av sensoriska neuroner och AKU motoriska nervceller. Använd juvenil 1-4 g Aplysia för isolering av L7 motoriska nervceller. Ta bort djuren försiktigt från saltvattensakvarium, och underhålla i havsvatten (i bägare, hink eller plastpåse) i högst 30 minuter innan anestesi och kultur förfarande.

Kultur förfarande

A. Odling Pleural Sensoriska nervceller från 80-100 g Aplysia

1. Bedöva djur för borttagning av ganglier: Injicera 0,35 M MgCl ₂ i vuxen Aplysia (80-100 g) med en 60 ml spruta med en 18 gauge 1,5 inch nål. Skriv in foten av djuret i en vinkel på ca 35 grader, och gör inte alltför djupt. Målet är att injicera i hemocoel av djuret utan att tränga in i inre organ. Djuret bör bli mycket utspänd och avslappnad.
2. Dissekera ganglierna: Pin de sövs djur på en dissekera skålen med en pin (18-gauge nålar fungerar bra för 80-100 g djur) på huvudet och svansen, och foten uppåt. Håll foten med en tandad pincett och skär genom huden och underliggande bindväv hela längden av foten (från huvud till svans) med en kirurgisk sax. Pin de två sidorna ner. Med hjälp av en pincett och sax, klipp matstrupen och dra åt sidan för att exponera ganglierna. Med hjälp av en fin pincett och fin sax, klippa ut pleura pedalen ganglierna (sensoriska nervceller i pleural ganglierna). Lämna en hel del nerv eftersom detta gör det lättare att sätta fingret på ganglierna efter proteas behandling.
3. Proteas rötning av ganglier: Placera ganglierna i proteas-lösning (10 mg / ml 1 enhet / mg L15) i en inkubator inställd på 34,5 ° C (34-35 ° C är okej) för 2 timmar och 15 min. Använda fin spets pincett för att överföra och tvätta ganglierna i ASW tre gånger. Håll ganglierna i L15. Observera att proteas inkubationstiden kan variera. Syftet är att låta bindväv lätt kan avlägsnas. Om det är för svårt att desheath de ganglierna utan att skada nervceller, öka tiden proteas inkubation. Om det är mycket lätt att desheath de ganglierna, och nervceller är "mjuka", minska den tid proteas inkubation.
4. Desheathing den ganglierna: Överför proteas-rötas ganglier till en 60 mm eller 35 mm maträtt som innehåller sylgard och L15. Visar under ett stereomikroskop (med extern halogenbelysning), ta bort pedalen ganglierna och stift ner pleura ganglierna i Sylgard skålen i rätt riktning med hjälp av insekter stift och en fin pincett. Med den fina pincett och en Vanna kirurgisk sax, försiktigt lyfta bindväv och skär den att exponera sensoriska klustret. Var noga med att inte någonsin vidröra eller skada neuronala somata. Ta bort överflödigt bindväv från skålen och lägga till mer medel, och se till att aldrig utsätta desheathed ganglion till luft. Den sensoriska kluster består av cirka 200 klustrade nervceller på 40-50 micron diameter. Ställ in en nål för att göra en "post" på ett kort avstånd från gangljon (inom synfältet).
5. Isolering av nervceller: Med långa, vassa elektrod glas kultur, dra ut de identifierade nervceller en efter en genom att trycka på cellkroppen strax utanför centrum (inte spetsa) och långsamt och stadigt dra cellen soma, tillsammans med axonet, bort från ganglion. Knacka försiktigt mot stift för att lösgöra nervceller från elektroden.
6. Plating nervceller: Använd en pipetman (P10) för att överföra enskilda nervceller från Sylgard skålen en kultur maträtt. Innan du överför nervceller, medelstora pipettera kultur i spetsen så att plasten tips är belagd med hemolymph (detta hindrar nervceller från att fastna i plast). Var noga med att undvika att utsätta nervceller att eventuella luftbubblor eller något extrema krafter (dvs mycket försiktigt ta upp och ta bort nervceller från pipetteman). Fördela nervceller jämnt över skålen. Använd en vass elektrod att försiktigt raka processer och knacka ner dem till botten.
7. Inkubation: Lämna rätterna på mikroskop scenen i rumstemperatur i minst 3 timmar. Vi lämnar rutinmässigt dem över natten. Se till att mikroskop stadiet är oberörd under denna period. Täck scenen med aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Försiktigt överföra dem till ett 18 ° C inkubator.
8. Kulturer bör följa skålen inom ca 3 timmar och nya neurite tillväxten bör synas inom cirka 6-12 timmar. Tillväxten av isolerade sensoriska neuroner når en platå med DIV 3 eller 4. Observera att enstaka sensoriska neuroner Doe inte bilda autapses eller synapser kemiskt med varandra, även om de utgör elektriska gap junctions.

B. Beredning av sensoriska neuron-motorneuron cocultures

Sensoriska neuron bilda synaps med nervceller målet motor i kulturen. De vanligaste motoriska nervceller i AKU motoriska nervceller och L7 motoriska neuron, från buken ganglion. AKU motoriska nervceller är isolerade från vuxna (80-100 g) Aplysia, och det finns cirka 20 AKU motoriska nervceller per buken ganglion. Den L7 motorneuron är isolerad från juvenil (1-4 g) djur, och det finns bara en L7 per buken ganglierna. LFS motoriska nervceller är 40-50 mikrometer i diameter, varvas bland LE sensoriska neuroner nära roten av sifon nerv på ventrala yta buken ganglierna, och kännetecknas av en subtil mörkt pigment fläck i varje soma. Den L7 motorneuron är 100-150 mikrometer i diameter och är närvarande på den dorsala ytan av ganglion, på mitten kanten av vänstra sidan av ganglion. Även om det är mer ekonomiskt att använda AKU motoriska nervceller, är den stora storleken på L7 motor neuron fördelaktigt för vissa experiment. Den L11 motor neuron, också på rygg vänstra ytan av buken ganglion, caudal att L7 är en nontarget motorneuron och effektivt kan användas som en kontroll med vilken sensoriska neuron fasciculates men inte bildar kemiska synapser.

1. Bedöva djur för borttagning av ganglier. För AKU motoriska nervceller, gör som beskrivs för pleural sensoriska nervceller. För L7 motoriska nervceller, injicera 0,35 M MgCl ₂ i unga Aplysia (1-4 g) med en 10 ml spruta med en 21-gauge nål.
2. Dissekera buken ganglierna: Stift de sövs djur på en dissekera maträtt som beskrivits ovan (med 21 gauge nålar för unga djur). Med hjälp av en fin pincett och fina saxar, skär ut buken ganglierna.
3. Proteas rötning av ganglier: Detta görs som beskrivs för pleural sensoriska neuroner, förutom att koktiden minskas till 1 tim 45 min för ganglier från juvenil (1-4 g) djur.
4. Desheathing den ganglierna: Överför proteas-rötas ganglier till en 35 eller 60 mm maträtt som innehåller sylgard och L15. Visar under ett stereomikroskop (med extern halogen belysning), i ganglierna nere i Sylgard skålen i rätt riktning med hjälp av insekter stift och en fin pincett. Med den fina pincett och en Vanna kirurgisk sax, försiktigt lyfta bindväv och skär den att exponera neuronal cell organ. Att isolera AKU motoriska nervceller, nåla ganglion så att den ventrala ytan är vänd uppåt, och med en pincett dra bindväv slida tillbaka för att exponera hela hälften av ganglion innehåller AKU motoriska nervceller (till höger), desheath den Resterande delar av ganglion, ta bort alla bindväv från skålen och lägga till fler L15. Att isolera L7 eller L11 motor neuron, nåla ganglion så att ryggens ytan är vänd uppåt, och med en pincett dra bindväv slida tillbaka att exponera hälften av ganglion som innehåller både L7 och L11 (till vänster). Var noga med att inte någonsin vidröra eller skada neuronala somata. Placera ett stift för att göra en "post" på ett kort avstånd från ganglion (inom synfältet).
5. Isolering av nervceller: Ta bort nervceller med en vass elektrod som beskrivs i sensoriska nervceller. AKU nervceller differentiated från närliggande LE sensoriska neuroner på grundval av ett litet mörkt pigment fläck i deras somata. Den L7 neuron kan skiljas från den L11 neuron först eftersom L11 är caudal att L7, eftersom L11 cellkroppen är mer avlång i formen medan L7 cellkroppen är rundare och eftersom L11 axonet tenderar att filialen i två nära cellen kropp.
6. Plating nervceller: Använd en pipetman (P10) för att överföra enskilda nervceller från Sylgard skålen en kultur maträtt som beskrivits för den sensoriska nervceller.
7. Para ihop med sensoriska neuroner: Låt den motoriska nervcellerna följer kulturen skålen i minst 1 timme. Tillsätt sedan den isolerade sensoriska nervceller med en pipetman, levererar varje sensoriska neuron i anslutning till ett pläterat motorneuron. Med en vass glaselektrod försiktigt räta ut de sensoriska neuron axonet, och koax sensoriska cellkroppen till en position bredvid motor neuron, på ett avstånd lika med eller något mindre än längden av den sensoriska cellen axonet. Använda glaselektrod, lirka den sensoriska axon att komma i kontakt med motor neuron, mycket försiktigt med sidan av koniska elektroden att äntligen ha sensoriska axon fysiskt kontakt axonet av motorn neuron. Lyft inte kulturen skålen, utan snarare försiktigt glida skålen längs mikroskop scenen.
8. Låt rätterna på mikroskop scenen i rumstemperatur i minst 3 timmar och transfer till en 18 ° C inkubator som beskrivs i sensoriska nervceller.
9. Kulturer bör följa skålen inom ca 3 timmar och nya neurite tillväxten bör synas inom cirka 6-12 timmar. Sensoriska neuroner bildar glutamaterg synapser med motoriska nervceller mycket snabbt - så fort cellen anhängare nog att utföra skarpa elektrod inspelning (3-5 timmar), en excitatoriska postsynaptiska potentialen kan spelas in. Synaptic anslutningar fortsätter att öka fram till DIV 3, och är därefter stabila till DIV7. Nervceller ska visa utarbeta neurite utväxt under de första en till tre dagar i kulturen.

C. Beredning av Hemolymph

Hemolymph används som en tillväxtfaktor i Aplysia kultur (analogt med användning av fetalt kalvserum i däggdjursceller kultur). Det samlas in från stor (500 g-1 kg) djur, och den bästa tiden att samla hemolymph (anekdotiskt) är under våren (mitten av mars till juni). Linda djuret i en disponibel underpad så att endast en liten del av djuret är utsatt, ren den del av huden med etanol, och sedan hålla den medan en annan person använder ett sterilt rakblad för att göra ett snitt i det exponerade området. Pressa djuret så att hemolymph sprutar i en ren bägare, se till att den inte kontakt med smutsiga huden på djuret. Den hemolymph fyller hemocoel av djur (dvs djuret är i grunden en säck av hemolymph). Omsorgsfullt slå djuret en eller två gånger, göra ett nytt snitt och pressa hårt för att samla in så mycket hemolymph som möjligt (samla i en ny bägare så att om den blir förorenad, är den första kollektionen fortfarande användbar). Hemolymph från varje djur ska hållas separat (dvs. inte poolen hemolymph från olika djur). Snurra hemolymph vid 2000 xgi 10 minuter för att ta bort blodkroppar. Alikvotera supernatanten i 10 ml alikvoter, etikett av djur-och förvara vid -80 ° C. Observera att hemolymph förvaras vid -20 ° C bildar en fällning i medium. Ett nytt delprov av hemolymph måste användas varje gång odlingsmedium är beredd, och delprov ska tinas strax före förbereda medium. Inte frysas på nytt efter upptining.

Discussion

I utarbetandet av ett Aplysia sensomotorisk kulturer har en något långsam inlärningskurva, eftersom det innebär utveckling av finmotorik förknippade med microdissection och manipulation av enskilda nervceller betraktas genom ett stereomikroskop. Enligt vår erfarenhet tar det ca 1-3 veckors praktik för att få friska isolerade sensoriska neuroner i kultur och ytterligare 1-3 veckor att lära sig att para sensoriska nervceller med motoriska nervceller. Vi förbereder rutinmässigt kulturer i en Labconco sterilbänk, även om det är möjligt att förbereda dem på något laboratorium bänk eller skrivbord, så länge mikroskop är ostörda under odling (eventuella vibrationer eller mekaniska störningar hindrar nervceller från att fastna). Sedan nervceller växer i havsvatten vid 18 ° C, bakterie-och svampinfektioner föroreningar är betydligt mindre vanligt än i däggdjursceller cellkultur. Den enskilt viktigaste variabeln i kulturen förberedelse är kvaliteten på djuret. Aplysia kan antingen köpas från leverantörer som samlar in dem direkt från Stilla Havet (snabbhet, eller Marinus), eller från University of Miami havsbruk anläggning, som samlar häckande par från Stilla havet och sedan växer Aplysia genom en avel cykel. Som sådan, djuren är genetiskt heterogena, och i fråga om sådana djur som samlats in från havet, de är också heterogena i termer av deras miljöhistoria. Det finns vissa säsongsvariationer för kvaliteten på nervceller från Aplysia, med den värsta perioden vanligtvis uppstår i augusti, och en annan lägre kvalitet perioden runt december. En annan viktig variabel är hemolymph. Det är klokt att testa olika partier av hemolymph för deras tillväxtfrämjande kapacitet, och att använda samma parti hemolymph för en rad experiment.

Trots svårigheten att förbereda Aplysia neuronala kulturer, har de ett antal unika och värdefulla fördelar till studiet av synaps bildning och synaptisk plasticitet. De bildar monosynaptic anslutningar i kulturen som kan övervakas av skarpa elektrod inspelning för perioder av dagar. Väl karakteriserade protokoll finns som framkallar former av plasticitet som har tydliga paralleller i djurets beteende. Stimuli kan tillämpas på badet eller delmängder av synapses6, 7 och geometri av kulturer kan varieras så att en sensoriska neuron kontakter en motor neuron, eller ett sensoriska neuron med en tvåspetsnitar axonet kontakter två motoriska nervceller, eller två sensoriska nervceller kontaktar en enskild motorneuron. Molekylära och cellbiologiska vägar kan ändras i enskilda nervceller genom mikroinjektion av DNA, RNA, siRNA och andra reagenser, och effekterna på neuronal struktur och funktion, synaptisk transmission och plasticitet kan övervakas med tidsmässiga och geografiska. NIH och Broad Institute närmar sig slutförandet av sekvensering av Aplysia genomet, vilket bör

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.