De voorbereiding van Aplysia Sensory-motor Neuronale Cell Cultures

Summary

Primaire culturen van

Abstract

Het zenuwstelsel van de mariene weekdier Aplysia californica is relatief eenvoudig, bestaande uit ongeveer 20.000 neuronen. De neuronen zijn groot (tot 1 mm in diameter) en identificeerbaar, met verschillende maten, vormen, posities en pigmentaties, en de cellichamen worden extern blootgesteld in vijf gepaarde ganglia verspreid door het hele lichaam van het dier. Deze eigenschappen hebben toegestaan ​​onderzoekers om de circuits onderliggende specifieke gedragingen in het dier ^een af te bakenen. De monosynaptic verbinding tussen sensorische en motorische neuronen is een centraal onderdeel van de kieuw-terugtrekking reflex in het dier, een eenvoudige defensieve reflex, waarin het dier zijn kieuw terugtrekt in reactie op tactiele stimulatie van de sifon. Deze reflex ondergaat vormen van non-associatief en associatief leren, met inbegrip van sensibilisering, habituatie en klassieke conditionering. Van bijzonder voordeel voor de studie van de synaptische plasticiteit, kan de sensomotorische synaps worden gereconstitueerd in cultuur, waar de goed gekarakteriseerde stimuli ontlokken vormen van plasticiteit die direct samenhangt met het gedrag van het dier ^2,3 te hebben. In het bijzonder, de toepassing van serotonine produceert een synaptische versterking die, afhankelijk van de toepassing protocol, duurt minuten (op korte termijn faciliteren), uren (tussen-termijn facilitatie) of dag (op lange termijn faciliteren). In tegenstelling tot de toepassing van de peptide zender FMRFamide produceert een synaptische verzwakking of depressie die, afhankelijk van de toepassing protocol, kan duren van minuut tot dag (op lange termijn depressie). De grote omvang van de neuronen kunnen voor herhaalde scherpe elektrode opname van synaptische kracht over periodes van dagen, samen met micro-injectie van expressievectoren, siRNA's en andere verbindingen voor specifieke signaleringscascades en moleculen richten en daarmee de moleculaire en celbiologische stappen die de veranderingen ten grondslag liggen in synaptische werkzaamheid.

Een bijkomend voordeel van de Aplysia cultuur systeem komt uit het feit dat de neuronen synaps-specificiteit te tonen in de cultuur ^4,5. Dus, doe sensorische neuronen vormen geen synapsen met zichzelf (autapses) of met andere sensorische neuronen, noch hebben ze synapsen vormen met non-target-geïdentificeerde motorische neuronen in cultuur. De varicosities, sites van synaptische contact tussen de zintuiglijke en motorische neuronen, zijn groot genoeg (2-7 micron in diameter), zodat synapsvorming (evenals veranderingen in de synaptische morfologie), met een doelgroep van motorische neuronen te bestuderen in het licht microscopisch niveau.

In deze video laten we zien elke stap van de voorbereiding sensomotorische neuron culturen, waaronder verlamming volwassen en jeugdige Aplysia, ontleden hun ganglia, protease vertering van het ganglia, de verwijdering van het bindweefsel door microdissectie, de identificatie van zowel de sensorische en motorische neuronen en verwijdering van elk celtype door microdissectie, aan beplating van de motor neuron, toevoeging van de sensorische neuron en manipulatie van de zintuiglijke neurieten formulier contact met de beschaafde motor neuron.

Protocol

De voorbereiding (zie hoofdstuk oplossingen aan het einde van het protocol voor de samenstelling van de oplossingen)

1. Bereid cultuur gerechten. Laag glas goed van Mattek glazen bodem cultuur schotel met poly-L-lysine (made in natriumboraat). Voeg genoeg om volledig goed dekking van de glas-en voor> 1 uur (kan 's nachts worden gelaten) te verlaten. Grondig de poly-l-lysine te verwijderen door spoelen in kunstmatig zeewater (ASW) 4-5 keer. Na het verwijderen van het laatste spoelwater, voeg 2 ml van 50% L15 (aangevuld met zouten en met L-glutamine bij een uiteindelijke concentratie van 2 mm) / 50% hemolymfe. Deze cultuur medium moet in de schaal te zijn voor ten minste een uur voorafgaand aan de plating cellen, zodat de jassen hemolymfe de schotel.
2. Het reinigen van de gereedschappen en Sylgard gerechten met ethanol, grondig met DDH ₂ 0 en deze vervolgens plaats voor> 1 uur onder een UV-licht in de cultuur kap.
3. Bereiden op scherp elektroden voor microdissectie van neuronen. Met behulp van een micro-elektrode trekker (bijv. Sutter Flaming Brown P-97), glazen pipet elektroden trekken met 1,5 mm buitendiameter, 0,86 tot 1,12 mm, inwendige diameter en 100 mm lengte (bijv. AM-systeem catalogus # 628000; Wereld precisie-instrumenten TW150-4, 1,55 / 1,12). Gebruik parameters die een elektrode te produceren met een lange en piekerig fijne tip van een dergelijke hoge weerstand, dat er geen capillaire inname van vocht wanneer geplaatst in oplossing. De aanwezigheid van een vloeistof meniscus houdt in dat de elektrode tip neuron schade tijdens het isolement. De Sutter elektrode kookboek biedt een uitstekende richtlijnen voor het opzetten van elektrode-programma's. We maken gebruik van een box filament, en een een-staps te trekken voor cultuur elektroden te genereren.
4. Bereid verdoving oplossing (0,35 m MgCl2), kweekmedium (L15 aangevuld met zouten en hemolymfe) en protease-oplossing (1% protease type IX, Sigma, een eenheid / mg, tot een uiteindelijke concentratie van 10 eenheden / ml).
5. Dieren: gebruik voor volwassenen 80-100 g Aplysia voor het isoleren van sensorische neuronen en van de LFS motorneuronen. Gebruik juveniele 1-4 g Aplysia voor het isoleren van L7-motorneuronen. Verwijder voorzichtig de dieren uit het zeewater tanks, en te onderhouden in zeewater (in de beker, emmer of plastic zak) voor niet meer dan 30 minuten voor het begin van de anesthesie en cultuur procedure.

Cultuur procedure

A. kweken Pleurale Sensorische neuronen van 80-100 g Aplysia

1. Verdoven van de dieren voor het verwijderen van ganglia: Injecteer 0,35 M MgCl ₂ tot volwassen Aplysia (80-100 g) met behulp van een 60 ml spuit met een 18 gauge 1,5 inch naald. Voer de voet van het dier in een hoek van ongeveer 35 graden, en voer niet te diep. Het doel is om in de hemocoel van het dier te injecteren zonder dat het penetreren van de interne organen. Het dier moet erg opgezwollen en ontspannen.
2. Ontleden van de ganglia: Speld de verdoofde dier op een dissectie schotel, met een pin (18-gauge naalden werken goed voor 80-100 g dieren) aan de kop en de staart, en de voet naar boven. Houd de voet met een getande tang en snijd door de huid en het onderliggende bindweefsel de volledige lengte van de voet (van kop tot staart) met een chirurgische schaar. Naar beneden pin van de twee kanten. Met behulp van een tang en schaar, knip de slokdarm en aan de kant om de ganglia bloot te leggen. Met behulp van een fijn pincet en fijne schaar, knip de pleura pedaal ganglia (de sensorische neuronen in de ganglia pleura). Laat een behoorlijke hoeveelheid van de zenuwen omdat dit maakt het makkelijker vast te pinnen de ganglia na protease behandeling.
3. Protease vertering van ganglia: Plaats de ganglia in protease-oplossing (10 mg / ml van een eenheid / mg in L15) in een incubator ingesteld op 34,5 ° C (34-35 ° C is goed) voor 2 uur en 15min. Met behulp van de fijne punt tang te dragen en de ganglia wassen in ASW drie keer. Houd de ganglia in L15. Merk op dat de protease incubatietijd kan variëren. Het doel is om het bindweefsel te gemakkelijk worden verwijderd. Als het te moeilijk is om de ganglia desheath zonder beschadiging van de neuronen, verhoging van de protease incubatietijd. Als het zeer eenvoudig om desheath de ganglia, en de neuronen zijn "zacht" vermindering van de protease incubatietijd.
4. Desheathing de ganglia: Breng de protease-verteerde ganglia naar een 60 mm of 35 mm schotel met Sylgard en L15. Weergave in een stereo-microscoop (met externe halogeen verlichting), verwijder pedaal ganglia en pinnen de pleura ganglia in de Sylgard schotel in de juiste richting met behulp van insecten pennen en een boete tang. Met de fijne pincet en een Vanna chirurgische schaar, til het bindweefsel en snijd het om de zintuiglijke cluster bloot te leggen. Wees voorzichtig dat u nooit aanraken of beschadiging van de neuronale somata. Verwijder eventueel overtollig bindweefsel van de schotel en voeg meer medium, en zorg ervoor dat de desheathed ganglion nooit bloot aan de lucht. De sensorische cluster bestaat uit ongeveer 200 geclusterde neuronen van 40-50 micron diameter. Stel een pin op een "post" te maken op een korte afstand van de Ganglion (binnen het gezichtsveld).
5. Isolatie van neuronen: Het gebruik van lange, scherpe glas cultuur elektrode, trek de geïdentificeerde neuronen een voor een door het aanraken van het cellichaam net buiten het centrum (niet doorboren) en langzaam en gelijkmatig te trekken van de cel soma, samen met de axon, weg van de ganglion. Tik voorzichtig tegen de pin aan de neuronen los van de elektrode.
6. Plating neuronen: Gebruik een Pipetman (P10) om individuele neuronen transfer van de Sylgard schotel naar een cultuur schotel. Voor de overdracht van de neuronen, pipet kweekmedium in de punt, zodat het plastic uiteinde is bekleed met hemolymfe (dit voorkomt dat de neuronen van het vasthouden aan het plastic). Neem de grote zorg om te voorkomen dat de neuronen om eventuele luchtbellen of een extreme krachten (dat wil zeggen zeer zachtjes nemen en de neuronen van de pipetteman te verwijderen). Verdeel de neuronen gelijkmatig over de schotel. Gebruik een scherpe elektrode voorzichtig recht van de processen en tik ze naar beneden naar de bodem.
7. Incubatie: Laat de gerechten op microscoop het podium bij kamertemperatuur voor niet minder dan 3 uur. We routinematig 's nachts laten. Zorg ervoor dat de microscoop podium is onverstoord in deze periode. Bedek het podium met aluminium folie ter bescherming tegen licht. Voorzichtig overbrengen naar een 18 ° C incubator.
8. Culturen moeten zich houden aan de schotel in ongeveer 3 uur en de nieuwe neurieten groei moet zichtbaar zijn binnen ongeveer 6-12 uur. De groei van geïsoleerde sensorische neuronen bereikt een plateau door DIV 3 of 4. Merk op dat geïsoleerde sensorische neuronen doe geen vorm autapses of chemische synapsen met elkaar, hoewel ze behoren tot elektrisch gap junctions doen.

B. Bereiding van sensorische neuron-motorische neuron cocultures

Sensorische neuronen vorm synaps met een doelgroep van motorische neuronen in cultuur. De meest gebruikte motorische neuronen zijn de LFS motorneuronen en de L7 motor neuron, uit de buik ganglion. De LFS motorische neuronen worden geïsoleerd uit volwassen (80-100 g) Aplysia, en er zijn ongeveer 20 LFS motorneuronen per buik ganglion. De L7 motor neuron is geïsoleerd van jonge (1-4 g) dieren, en er is slechts een L7 per buik ganglia. LFS motorische neuronen zijn 40-50 micron in diameter, afgewisseld behoren tot de LE sensorische neuronen dicht bij de wortel van de sifon zenuwen op het ventrale oppervlak van de buik ganglia, en worden gekenmerkt door een subtiele donkere pigment vlek in elk soma. De L7 motor neuron is 100-150 micron in diameter en is aanwezig op het dorsale oppervlak van het ganglion, op de middelste rand van de linker kant van het ganglion. Hoewel het voordeliger om LFS motorneuronen te gebruiken, de grote omvang van de L7 motor neuron is voordelig voor enkele experimenten. De L11 motor neuron, ook op de rug links oppervlak van de buik-ganglion, caudaal van L7, is een nontarget motor neuron en effectief kan worden gebruikt als een controle waarbij de sensorische neuron fasciculates, maar maakt geen chemische synapsen.

1. Verdoven van de dieren voor het verwijderen van ganglia. Voor de LFS motorneuronen, doe zoals beschreven voor pleurale sensorische neuronen. Voor L7 motorneuronen, injecteren 0,35 M MgCl ₂ in juveniele Aplysia (1-4 g) met behulp van een 10 ml spuit met een 21-gauge naald.
2. Ontleden de abdominale ganglia: Speld de verdoofde dier op een dissectie schotel zoals hierboven beschreven (met behulp van 21 gauge naalden voor jonge dieren). Met behulp van een fijn pincet en fijne schaar, knip de buik ganglia.
3. Protease vertering van ganglia: Dit wordt gedaan zoals beschreven voor pleurale sensorische neuronen, behalve dat de spijsvertering de tijd wordt teruggebracht tot 1 uur 45 min voor de achterwortelganglia van juveniele (1-4 g) dieren.
4. Desheathing de ganglia: Breng de protease-verteerde ganglia naar een 35 of 60 mm schotel met Sylgard en L15. Weergave in een stereo-microscoop (met externe halogeen verlichting), in de ganglia in de Sylgard schotel in de juiste richting met behulp van insecten pennen en een boete tang. Met de fijne pincet en een Vanna chirurgische schaar, til het bindweefsel en snijd het aan de neuronale cellichamen bloot te leggen. Te isoleren van de LFS motorneuronen, pin het ganglion, zodat het ventrale oppervlak naar boven, en met een tang terug te trekken het bindweefsel schede om de gehele helft van het ganglion met de LFS motorische neuronen (aan uw rechterhand), desheath de bloot resterende delen van het ganglion, verwijder eventuele bindweefsel uit de schotel en voeg meer L15. Te isoleren van de L7 of L11 motor neuron, pin het ganglion, zodat het dorsale oppervlak naar boven is gericht, en met een tang terug te trekken het bindweefsel schede om de helft van het ganglion die zowel L7 en L11 (aan uw linkerhand) bloot te leggen. Wees voorzichtig dat u nooit aanraken of beschadiging van de neuronale somata. Plaats een pin op een "post" te maken op een korte afstand van het ganglion (binnen het gezichtsveld).
5. Isolatie van neuronen: Verwijder neuronen met een scherp elektrode zoals beschreven voor de sensorische neuronen. De LFS neuronen zijn differentiated van naburige LE sensorische neuronen aan de hand van een kleine donkere pigment vlek in hun somata. De L7 neuron kan worden onderscheiden van de L11 neuron eerste omdat de L11 is caudaal van L7, omdat het L11 cellichaam is meer langwerpig van vorm, terwijl het L7 cellichaam is ronder en omdat de L11 axon heeft de neiging om tak in twee dicht bij de cel lichaam.
6. Plating neuronen: Gebruik een Pipetman (P10) om individuele neuronen transfer van de Sylgard schotel naar een cultuur schotel zoals beschreven voor de sensorische neuronen.
7. Koppelen met sensorische neuronen: Laat de motor neuronen van de cultuur schotel zich voor minstens een uur. Dan is de geïsoleerde sensorische neuronen toe te voegen met een Pipetman, het leveren van elk sensorisch neuron grenzend aan een vergulde motor neuron. Met behulp van een scherpe glaselektrode voorzichtig recht uit de sensorische neuron axon, en de zintuiglijke cellichaam naar een positie naast de motor neuron coax, op een afstand die gelijk is aan of iets minder dan de lengte van de sensorische cel axon. Met behulp van de glaselektrode, coax de sensorische axon om in contact te komen met de motor neuron, heel voorzichtig met behulp van de kant van de taps toelopende elektrode om eindelijk de sensorische axon fysiek het axon van de motor neuron contact. Til de cultuur schotel, maar wel voorzichtig glijden de schotel langs de microscoop podium.
8. Laat de gerechten op microscoop het podium bij kamertemperatuur voor niet minder dan drie uur en over te dragen aan een 18 ° C incubator zoals beschreven voor de sensorische neuronen.
9. Culturen moeten zich houden aan de schotel in ongeveer 3 uur en de nieuwe neurieten groei moet zichtbaar zijn binnen ongeveer 6-12 uur. Sensorische neuronen vorm glutamaat synapsen met een motorische neuronen zeer snel - zodra de cel zijn aanhanger genoeg om scherp elektrode opname (3-5 uur), een excitatoire postsynaptische potentieel kan worden opgenomen uit te voeren. Synaptische connectiviteit blijft stijgen tot DIV 3, en is dan stabiel tot DIV7. De neuronen moet blijken uitgebreide neurietuitgroei tijdens de eerste een tot drie dagen in de cultuur.

C. Voorbereiding van de hemolymfe

Hemolymfe wordt gebruikt als een groeifactor in Aplysia cultuur (analoog aan het gebruik van foetaal kalf serum in zoogdiercellen cultuur). Het wordt verzameld van grote (500 g-1 kg) dieren, en de beste tijd om hemolymfe te verzamelen (anekdotische) is tijdens de lente (half maart tot juni). Swaddle het dier in een wegwerp underpad, zodat slechts een klein deel van het dier is blootgesteld, schoon dat deel van de huid met ethanol, en dan houd deze vast terwijl een andere persoon maakt gebruik van een steriel scheermesje om een ​​insnijding in de belichte gebied. Knijp het dier, zodat het hemolymfe spuit in een schone beker en zorg ervoor dat het niet de vuile huid van het dier contact. De hemolymfe vult de hemocoel van het dier (dat wil zeggen, het dier is eigenlijk een zak van hemolymfe). Herindelen van het dier een of twee keer, maak een nieuwe incisie en moeilijk om zo veel hemolymfe te verzamelen als mogelijk knijpen (te verzamelen in een nieuwe beker zodat als het wordt besmet, de eerste collectie is nog steeds bruikbaar). Hemolymfe van elk dier afzonderlijk worden gehouden (dat wil zeggen, geen zwembad hemolymfe van verschillende dieren). Spin de hemolymfe bij 2000 xg gedurende 10 min aan bloedcellen te verwijderen. Aliquot het supernatant in 10 ml porties, label door dierlijke en bewaar bij -80 ° C. Merk op dat hemolymfe opgeslagen bij -20 ° C een neerslag vormt in medium. Een nieuwe portie van hemolymfe moet worden gebruikt telkens wanneer kweekmedium is voorbereid, en de hoeveelheid moet vlak voor worden ontdooid ter voorbereiding van de medium. Niet opnieuw invriezen na het ontdooien.

Discussion

Het welslagen van de voorbereiding van de Aplysia sensomotorische culturen heeft een wat trage leercurve, omdat het gaat om de ontwikkeling van de fijne motoriek in verband met microdissectie en manipulatie van individuele neuronen gezien door een stereo-microscoop. In onze ervaring, duurt het ongeveer 1-3 weken van de praktijk aan gezonde geïsoleerd sensorische neuronen in cultuur en een extra 1-3 weken krijgen om te leren hoe sensorische neuronen koppelen met motorische neuronen. We routinematig bereiden culturen in een Labconco Clean Bench, hoewel het mogelijk is om hen voor te bereiden op een laboratoriumtafel of bureau, zolang de microscoop is onverstoord tijdens het kweken (eventuele trillingen of mechanische storingen te voorkomen dat de neuronen van de hechtende). Sinds de neuronen groeien in zeewater bij 18 ° C, bacteriën en schimmels verontreinigingen zijn aanzienlijk minder vaak voor dan in zoogdiercellen cultuur. De belangrijkste variabele in de bereiding is de kwaliteit van het dier. Aplysia kan worden gekocht van leveranciers die het verzamelen van deze rechtstreeks vanaf de Stille Oceaan (bereidwilligheid, of Marinus), of van de Universiteit van Miami Maricultuur faciliteit, die broedparen verzamelt van de Stille Oceaan en daarna groeit Aplysia door een broedcyclus. Als zodanig, de dieren zijn genetisch heterogeen, en, in het geval van de dieren verzameld uit de oceaan, ze zijn ook heterogeen in termen van hun milieu-geschiedenis. Er is een aantal seizoensgebonden om de kwaliteit van de neuronen verkregen van Aplysia, met de slechtste periode meestal optredend in augustus, en een lagere kwaliteit periode rond december. Een andere belangrijke variabele is de hemolymfe. Het is verstandig om verschillende batches van hemolymfe te testen voor hun groei-bevordering van capaciteitsopbouw, en om dezelfde partij hemolymfe te gebruiken voor een reeks experimenten.

Ondanks de moeilijkheid van de voorbereiding Aplysia neuronale culturen, ze bezitten een aantal unieke en waardevolle voordelen van de studie de vorming van synapsen en synaptische plasticiteit. Ze vormen monosynaptic verbindingen in de cultuur die kunnen worden gecontroleerd door scherp elektrode opnemen voor een periode van dagen. Goed gekarakteriseerd protocollen bestaan ​​die oproepen vormen van plasticiteit dat duidelijk parallellen in het gedrag van het dier hebben. Prikkels kan worden toegepast op het bad of subsets van synapses6, 7, en de geometrie van culturen kan worden gevarieerd, zodat een sensorische neuron contacten een motor neuron, of een sensorische neuron met een gespleten axon contacten twee motorische neuronen, of twee zintuiglijke neuronen contact op met een individuele motor neuron. Moleculaire en celbiologische paden kan worden veranderd in individuele neuronen door micro-injectie van DNA, RNA, siRNA en andere reagentia, en de effecten op de neuronale structuur en functie, synaptische transmissie en plasticiteit kunnen worden gevolgd met temporele en ruimtelijke resolutie. De NIH en Broad Institute naderen hun voltooiing van de sequentiebepaling van het genoom Aplysia, die moet

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.