Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

Summary

Primer kültürler

Abstract

Deniz yumuşakça Aplysia californica sinir sistemi, yaklaşık 20.000 nöronların oluşan, oldukça basittir . Nöronlar, farklı boyutları, şekilleri, konumları ve pigmentations, büyük (çapı 1 mm kadar) ve tanımlanabilir ve hücre organları dışarıdan hayvanın vücut boyunca dağıtılan beş eşleşmiş ganglionlarda maruz kalmaktadır. Bu özellikler araştırmacılar hayvan ¹ belirli davranışların altında yatan devreleri tanımlamak için izin verdiler. Duyu ve motor nöronlar arasındaki monosinaptik bağlantı, hayvan solungaç çekilme refleks merkezi bir bileşeni, hayvan sifon dokunsal uyarılara yanıt solungaç çekilmesi basit bir savunma refleksi. Bu refleks hassaslaşması, alışkanlık ve klasik koşullanma da dahil olmak üzere non-ilişkisel ve ilişkisel öğrenme biçimleri, uğrar. Sinaptik plastisite çalışmada özellikle yarar, iyi karakterize uyaranlara ^2,3 hayvan davranışlarını doğrudan ilişkilendiren plastisite biçimleri ortaya duyusal-motor sinaps, kültür sulandırılmış olabilir. Özellikle, serotonin uygulama, uygulama protokolü bağlı olarak, (kısa vadeli kolaylaştırma) dakika süren bir sinaptik güçlendirilmesi, saat (orta vadeli kolaylaştırma) veya gün (uzun vadeli kolaylaştırma) üretir. Buna karşılık, peptid verici FMRFamide uygulama uygulama protokolü bağlı olarak, (uzun vadeli depresyonu) gün dakika sürebilir, sinaptik zayıflaması veya depresyon üretir. Büyük boy nöronların sinaptik gücü ifade vektörler, siRNA'lar ve diğer bileşikler, özel sinyalizasyon kaskadlar ve moleküller hedef mikroenjeksiyon ile birlikte gün süre tekrarlanan keskin elektrot kayıt için izin verir ve böylece, değişikliklerin altında yatan moleküler ve hücre biyolojik adımları belirlemek sinaptik etkinliği.

Aplysia kültür sistemi ek bir avantajı, nöronlar ^kültür 4,5 sinaps-özgüllük göstermektedir ki gerçeğinden geliyor . Böylece, duyusal nöronlar edilebilir (autapses) ya da diğer duyusal nöronlar ile sinaps formu değil, ne de kültürü olmayan hedef tespit edilen motor nöronlar ile sinaps formu. Varisler, duyu ve motor nöronlar arasındaki sinaptik temas siteleri, ışık mikroskobik düzeyde incelenmesi gereken hedef motor nöronlar ile sinaps oluşumu (yanı sıra, sinaptik morfoloji değişiklikleri) izin için yeterli (çapı 2-7 mikron) büyük.

Bu video, anestezi yetişkin ve çocuk Aplysia dahil olmak üzere, duyusal-motor nöron kültürleri, hazırlama, her adımı gösteren ganglionlar, gangliyon proteaz sindirim, bağ dokusu mikrodiseksiyon kaldırılması, duyu ve motor nöronlar ve kaldırma belirlenmesi diseksiyon mikrodiseksiyon ile her bir hücre tipi, motor nöron, duyusal neurite duyusal nöron ve manipülasyon ek kaplama kültürlü motor nöron iletişim formu.

Protocol

Hazırlama (bkz. çözümleri bölümünde çözümler kompozisyon için protokol sonunda)

1. Kültür yemekleri hazırlayın. Mattek ile poli-L-lisin (sodyum borat yapılan) cam alt kültür çanak Kat cam. Tamamen cam kapak ve> 1hr (gece sol olabilir) terk etmek yeterli ekleyin. Iyice poli-L-lisin, yapay deniz suyu (ASW) 4-5 kez durulayarak çıkarın. Çıkardıktan sonra, son durulama, 2 ml (tuzları ile desteklenmiş ve 2mm son bir konsantrasyonda L-glutamin içeren)% 50 L15 /% 50 hemolimf ekleyin. Bu kültür ortamı, en az bir saat önce kaplama hücreleri tabak içinde olmalıdır, böylece hemolimf kat çanak.
2. Araçları ve Sylgard yemekleri etanol ile temizleyin, GKD ₂ 0 ile iyice durulayın ve> 1 saat sonra kültür başlığı UV ışık altında koyun.
3. Nöronların mikrodiseksiyon keskin elektrotlar hazırlayın. Mikroelektrot çektirmesi (örneğin Sutter Flaming Brown P-97), 1.5 mm dış çapı, 0,86 - 1,12 mm iç çapı ve 100 mm uzunluğunda cam pipet elektrotlar çekin (örneğin sistem kataloğunda # 628,000; Dünya Hassas Aletler TW150-4, 1,55 / 1.12). Çözelti içinde yerleştirilmiş sıvı alımı Kılcal olduğu gibi yüksek direnç ve uzun bir tutam ince ucu ile bir elektrot üreten parametrelerini kullanın. Bir sıvı menisküs varlığı elektrot ucu izolasyon sırasında nöron zarar vereceği anlamına gelir. Sutter elektrot yemek kitabı elektrot programları kurmak için mükemmel kurallar sağlar. Biz bir kutu filament kullanın ve bir adım kültür elektrotlar oluşturmak için çekin.
4. Anestezik solüsyonun (0.35M MgCl2), kültür ortamı (L15 tuzları ve hemolimf ile desteklenmiş) ve proteaz solüsyonu (10 adet / ml 'lik bir final konsantrasyon% 1 proteaz tipi IX, Sigma, 1 ünite / mg,) hazırlayın.
5. Hayvanlar: duyusal nöronlar izolasyonu ve LFS motor nöronların yetişkin 80-100 gr Aplysia kullanın. Juvenil 1-4 g Aplysia L7 motor nöronların izolasyonu için kullanın. Deniz suyu tankları, yavaşça hayvanlar çıkarın ve anestezi ve kültür prosedürü başlamadan önce en fazla 30 dakika için (beher, kova veya plastik torba) deniz suyu korumak.

Kültür prosedürü

A. 80-100 gr Aplysia Kültürleme Plevral Duyu Nöronlar

1. Ganglionlar kaldırılması için hayvanların anestezisi: 0.35 M MgCl ₂ yetişkin Aplysia (80-100 gr) 18 gauge bir 1,5 inç iğne ile 60 ml şırınga kullanarak içine enjekte edilir. Yaklaşık 35 derecelik bir açıyla hayvanın ayak girin, ve çok derin girmeyin. Amaç iç organlara nüfuz olmadan hayvan hemocoel içine enjekte edilmesidir. Hayvan çok şişmiş ve rahat bir hale gelmelidir.
2. Ganglionlar teşrih: baş ve kuyruk bir iğne (18 gauge iğne 80-100 g hayvanlar için iyi çalışır) ve yukarı bakacak şekilde ayak, bir diseksiyon çanak anestezi hayvan Pin. Dişli forseps ile ayak tutun ve cerrahi makas ile deri ve alttaki bağ dokusu tam ayak uzunluğu (baş-kuyruk) kesti. Aşağı iki tarafın Pin. Bir forseps ve makas kullanarak, yemek borusu kesme ve ganglionlar maruz tarafına çekin. Ince bir forseps ve ince makas kullanarak, plevral pedal ganglionlar (duyusal nöronlar plevral ganglionlarda) kesti. Bu kolay Proteaz tedaviden sonra ganglionlar pin yapar bu yana adil bir miktar sinir bırakın.
3. Ganglionlar Proteaz sindirim: Yer proteaz çözüm ganglionlar (10 L15 1 ünite / mg mg / ml), 34.5 bir kuluçka set ° C (34-35 ° C tamam) 2 saat ve 15 dakika. Ince ucunu kullanarak, üç kez transfer forsepsi ve ASW ganglionlar yıkayın. L15 ganglionlar tutun. Proteaz inkübasyon süresi değişebilir unutmayın. Amacı, bağ dokusu kolayca temizlenebilir izin vermek. Nöronların zarar vermeden desheath ganglionlar çok zor ise, proteaz inkübasyon süresi artar. Desheath için son derece kolaydır ganglionlar, nöronlar "yumuşak" proteaz kuluçka süresini azaltmak.
4. Ganglionlar Desheathing: 60 mm veya 35mm çanak sylgard ve L15 içeren proteaz sindirilir ganglionlar aktarın. (Harici halojen aydınlatma ile) bir stereo-mikroskop altında görüntülenen kaldırmak ganglionlar pedalı ve böcek pimleri ve ince bir forseps kullanarak doğru yönde Sylgard çanak plevral ganglionlar aşağı pin. Ince forseps ve Vanna cerrahi makas ile bağ dokusu dikkatlice kaldırın ve duyusal küme maruz kesmek. Bugüne kadar dokunmayın veya nöronal somata zarar vermemek için dikkatli olun. Çanağı herhangi bir aşırı bağ dokusu çıkarın ve hava desheathed ganglion maruz asla emin olun, daha çok orta ekleyin. Duyusal küme 40-50 mikron çapında yaklaşık 200 kümelenmiş nöronlar oluşur. Gangl kısa bir mesafede bir "post" yapmak için bir iğne ayarlayın.iyon (görüş alanı içinde).
5. Nöronlar İzolasyonu: uzun, keskin cam kültür elektrot kullanarak, uzak bir yerde, akson ile birlikte, belirlenen nöronların hücre gövdesi dokunmadan sadece merkezden (Impale gerekmez) ve yavaş yavaş ve sürekli hücre soma çekerek tek tek çekin ganglion. Pin karşı elektrot nöronlar çıkarmak için hafifçe dokunun.
6. Kaplama nöronların bir kültür çanak Sylgard çanak tek tek nöronların transfer etmek için bir Pipetman (P10) kullanın. Nöronlar, pipetlemeyin kültür ortamı, plastik ucu hemolimf ile kaplanmış, böylece ucuna aktarmadan önce (bu nöronların plastik yapışmasını engeller). Herhangi bir hava kabarcıkları ya da nöronların aşırı güçlere (yani çok yavaş bir şekilde sürebilir ve pipetteman nöronlar kaldırmak) maruz kalmasını önlemek için çok dikkatli olun. Nöronlar çanak boyunca eşit olarak dağıtın. Düz süreçleri hafifçe keskin bir elektrot kullanın ve alt dokunun.
7. İnkübasyon: 3 saat daha az mikroskop sahnede yemekler oda sıcaklığında bekletin. Biz rutin olarak bir gece bırakın. Mikroskop aşamada bu dönemde soğukkanlı olduğundan emin olun. Sahne ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. 18 ° C inkübatör yavaşça aktarabilirsiniz.
8. Kültürler yaklaşık 3 saat içinde yemek için uygun ve yeni bir neurite büyüme yaklaşık 6-12 saat içinde görünür olmalıdır. Izole duyu nöronlarının büyüme, 3 veya 4 DIV bir platoya ulaşır. Izole duyusal nöronlar doe form autapses veya birbiri ile kimyasal sinaps, oluşturdukları elektrik gap junction rağmen unutmayın.

Duyusal nöron motor nöron cocultures B. Hazırlık

Duyu nöronları kültür hedef motor nöron sinaps oluşturur. En sık kullanılan motor nöronların karın ganglion LFS motor nöronlar ve L7 motor nöron. LFS motor nöronların yetişkin (80-100 g) Aplysia izole ve karın ganglion başına yaklaşık 20 LFS motor nöron vardır. L7 motor nöron juvenil (1-4 g) hayvanlardan izole ve karın ganglionlar başına sadece bir L7 var. LFS motor nöronlar, çapı 40-50 mikron karın ganglionlar ventral yüzeyinde sifon sinir köküne yakın LE duyusal nöronlar arasında serpiştirilmiş ve her soma ince bir koyu pigment spot ile karakterizedir. L7 motor nöron çapı 100-150 mikron ve ganglion ganglion sol tarafında orta kenarında dorsal yüzey mevcut. LFS motor nöronların kullanmak daha ekonomik olmasına rağmen, L7 motor nöron büyüklüğü bazı deneyler için avantajlıdır. L7 için kaudal karın ganglion, sol dorsal yüzey L11 motor nöron, bir nontarget motor nöron ve etkili duyusal nöron fasciculates ancak kimyasal sinaps formu olan bir kontrol olarak kullanılabilir.

1. Ganglionlar kaldırılması için, hayvanların anestezisi. LFS motor nöronlar için, plevral duyusal nöronlar için açıklanan yapmak. L7 motor nöronlar için, 0.35 M MgCl ₂ juvenil Aplysia (1-4 g) 21-gauge bir iğne ile 10 ml şırınga kullanarak içine enjekte edilir .
2. (Çocuk hayvanlar için 21 gauge iğne kullanılarak) yukarıda açıklandığı gibi bir diseksiyon çanak anestezi hayvan Pin: karın ganglionlar parçalara ayır. Ince bir forseps ve ince makas kullanarak, karın ganglionlar kesti.
3. Ganglionlar Proteaz sindirim: Bu sindirim süresi 1 saat 45 dk juvenil (1-4 g) Hayvanların ganglionlar azaltılmış olması dışında, plevra duyusal nöronlar için açıklandığı gibi yapılır.
4. Ganglionlar Desheathing: sylgard ve L15 içeren bir 35 veya 60 mm çanak proteaz sindirilir ganglionlar aktarın. Ganglionlar, böcek pimleri ve ince bir forseps kullanarak doğru yönde Sylgard çanak (harici halojen aydınlatma ile) bir stereo-mikroskop altında görüntüleniyor. Ince forseps ve Vanna cerrahi makas ile bağ dokusu dikkatlice kaldırın ve nöronal hücre gövdeleri maruz kesilmiş. LFS motor nöronların izole etmek için, ventral yüzey yukarı bakacak şekilde ganglion pin ve bir forseps ile LFS motor nöronların (sağda), desheath içeren ganglion tüm yarısında ortaya çıkarmak için geri çekme bağ dokusu kılıf ganglion kalan parçaları, çanak herhangi bir bağ dokusu kaldırmak ve daha L15 ekleyin. L7 veya L11 motor nöron izole etmek için, dorsal yüzey yukarı bakacak şekilde ganglion pin ve bir forseps ile L7 ve L11 (sol) hem de içeren ganglion yarısı maruz bağ dokusu kılıf geri çekin. Bugüne kadar dokunmayın veya nöronal somata zarar vermemek için dikkatli olun. Ganglion kısa bir mesafede (görüş alanı içinde) bir "post" yapmak için bir toplu iğne yerleştirin.
5. Nöronların İzolasyonu: duyusal nöronlar için açıklandığı gibi keskin bir elektrot ile nöronların çıkarın. LFS nöronlar farkkendi somata küçük bir koyu pigment spot temelinde komşu LE duyusal nöronlar erentiated. L11 L7 için kaudal çünkü L7 hücre gövdesi yuvarlak ise L11 hücre gövdesi, şekil olarak daha dikdörtgen çünkü iki yakın L11 akson hücre içine dal eğilimindedir çünkü L7 nöron, L11 nöron ilk ayırt edilebilir gövde.
6. Kaplama nöronlar: duyusal nöronlar için açıklandığı gibi bir kültür çanak Sylgard çanak tek tek nöronların transfer etmek için bir Pipetman (P10) kullanın.
7. Duyusal nöronlar ile eşleştirme: motor nöronların en az 1 saat süreyle kültür çanak bağlı olsun. Sonra izole duyusal nöronlar kaplı bir motor nöron bitişik her duyusal nöron teslim Pipetman ekleyin. Keskin bir cam kullanarak duyusal hücre akson uzunluğu biraz daha az veya eşit bir mesafeden dikkatle, duyusal nöron akson düzeltmek ve motor nöron yanında bir konuma duyusal hücre gövdesi koaksiyel elektrodudur. Cam elektrot kullanarak, duyusal akson sonunda fiziksel duyusal akson motor nöron akson temas konik elektrot tarafında kullanarak çok nazik, motor nöron ile temas için koaksiyel. Kültür çanak asansör, ancak oldukça nazik tabak mikroskop sahne boyunca kayma.
8. Duyusal nöronlar için açıklandığı gibi en az 3 saat ve 18 ° C inkübatör transfer için mikroskop sahnede yemekler oda sıcaklığında bekletin.
9. Kültürler yaklaşık 3 saat içinde yemek için uygun ve yeni bir neurite büyüme yaklaşık 6-12 saat içinde görünür olmalıdır. Duyu nöronları çok hızlı bir şekilde, motor nöron glutamaterjik sinaps formu - hücre keskin elektrot kayıt (3-5 saat), eksitatör post-sinaptik potansiyel kaydedilebilir gerçekleştirmek için yeterli yapışık olan en kısa sürede. Sinaptik bağlantı DIV 3 yılına kadar artmaya devam ediyor ve sonra DIV7 kadar stabildir. Nöronlar kültürünün ilk 1-3 gün boyunca ayrıntılı neurite akıbet göstermelidir.

C. hazırlanması, hemolimf

Hemolimf Aplysia kültüründe bir büyüme faktörü (memeli hücre kültürü fetal buzağı serumu kullanılması benzer) olarak kullanılır. Büyük (500 gr-1 kg) hayvanlardan elde toplanan ve hemolimf (anekdotal) toplamak için en iyi zaman ilkbahar (Mart ayının ortasında Haziran) sırasında. Hayvanın sadece küçük bir kısmının maruz kaldığı için, bir tek underpad hayvan kundak, etanol ile derinin o kısmı temiz, ve ardından başka bir kişi, açık alanda bir kesi yapmak için steril bir jilet kullanır iken tutun. Temiz bir behere hemolimf squirts, hayvan kirli cilt teması olmadığını emin olun, böylece hayvan sıkın. Hemolimf hayvan hemocoel (yani hayvan, temelde hemolimf bir kese) doldurur. (Kontamine haline gelirse, ilk koleksiyonu hala kullanılabilir böylece yeni bir beher toplamak) yeni bir kesi yapmak ve mümkün olduğunca çok hemolimf toplamak için sabit sıkmak, bir veya iki kez hayvan sarmaktır. Her hayvan hemolimf (yani, farklı hayvanların Havuzu hemolimf) ayrı ayrı tutulmalıdır. Kan hücreleri çıkarmak için 10 dakika 2000 xg'de hemolimf Spin. Kısım 10 ml alikotları süpernatant hayvan ve mağaza etiket -80 ° C. -20 ° C'de saklanan hemolimf orta bir çökelti oluşturur unutmayın. Hemolimf yeni bir kısım her zaman kültür ortamı hazırlanan olmalıdır ve kısım orta hazırlanıyor hemen önce çözdürülmelidir. Çözme sonrası dondurursam etmeyin.

Discussion

Stereo-mikroskop ile bakıldığında bireysel nöronlar mikrodiseksiyon ve manipülasyon ile ilişkili ince motor becerileri geliştirme içerdiğinden Aplysia duyusal-motor kültürlerin başarılı bir şekilde hazırlanması, biraz daha yavaş bir öğrenme eğrisi vardır. Bizim tecrübelerimize göre, duyusal nöron motor nöron çifti öğrenmek için sağlıklı kültür izole duyu nöronları ve ek olarak 1-3 hafta elde etmek için uygulama yaklaşık 1-3 hafta sürer. Biz rutin olarak bu sürece mikroskop kültür (herhangi bir titreşim veya mekanik bozuklukları nöronlar yapışmasını önlemeye) sırasında soğukkanlı olarak, herhangi bir laboratuvar tezgah veya masa hazırlamak mümkün olmasına rağmen, bir Labconco Temizlik Tezgah kültürler hazırlar. Nöronlar deniz suyunda yetişen 18 ° C, bakteriyel ve fungal kontaminasyonların memeli hücre kültüründe önemli ölçüde daha az yaygın. Kültür hazırlanmasında tek ve en önemli değişken hayvan kalitesidir. Aplysia ya Pasifik Okyanusu (alacrity, ya da Marinus), doğrudan ya da üreyen toplayan Miami Kültür balıkçılığı tesisi, Üniversitesi onları toplamak satıcılarından satın alınabilir Pasifik ve daha sonra bir üreme döngüsü boyunca Aplysia büyür . Gibi, hayvanların genetik olarak heterojen, okyanustan toplanan hayvanların durumda, çevresel geçmişi açısından da heterojen. En kötü dönemi genellikle Ağustos ayında meydana gelen bazı mevsimsellik Aplysia elde nöronların, kalite, ve daha düşük kalitede Aralık ayında başka bir dönem yoktur . Bir diğer önemli değişken hemolimf. Bu büyüme teşvik kapasitesi hemolimf farklı toplu test etmek için bir dizi deney için hemolimf aynı toplu kullanmak akıllıca olacaktır.

Aplysia nöronal kültürlerin hazırlanmasında zorluk rağmen, eşsiz ve değerli, sinaps oluşumu ve sinaptik plastisite çalışma avantajları bir dizi sahiptirler . Bu gün dönemleri için keskin elektrot kayıt izlenebilir kültür monosinaptik bağlantıları oluşturur. Iyi karakterize protokolleri hayvan davranışlarını açık paralellikler var plastisite biçimleri ortaya bu var. Uyaranlar banyo veya synapses6 altkümelerini, 7 uygulanabilir ve kültürlerin geometri çeşitli olabilir, böylece bir duyusal nöron bağlantıları tek bir motor nöron veya çatallı bir akson kişileri bir duyusal nöron iki motor nöronlar, ya da duyusal iki nöronlar bireysel bir motor nöron başvurun. Moleküler ve hücre DNA, RNA, siRNA ve diğer reaktifler mikroenjeksiyon biyolojik yollar ile bireysel nöronlar değiştirilemez ve nöron yapısı ve fonksiyonu, sinaptik iletim ve plastisite üzerindeki etkileri, zamansal ve mekansal çözünürlük ile izlenebilir. NIH ve Broad Enstitüsü, Aplysia genom diziliminin tamamlanması gereken yaklaşıyor

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.