Summary
在这个视频中，我们目前的
Abstract
CD40激活的B细胞（CD40 - B细胞）已被确定为肿瘤免疫治疗的免疫刺激抗原提呈细胞（APC）1-3的替代来源。树突状细胞（DCs），最好的APC，CD40 - B细胞有几个不同的生物和技术性能相比。与区议会，B细胞的MHC和共刺激分子（图1b）的表达增加，表现出强烈的的迁徙能力和目前的T细胞抗原提呈效率，刺激白细胞介素4和CD40配体（CD40L）。然而，在不成熟或成熟的DCS相比，CD40 - B细胞表达完整的淋巴结归巢CD62L，CCR7/CXCR4组成的黑社会，和白细胞功能抗原-1（LFA1，CD11a/CD18），归巢到次级淋巴器官所必需的（图1a）3。 CD40 - B细胞可以产生而没有从非常小，它可以进一步扩大在体外大量高纯度CD40的B细胞（> 10 9细胞每名患者）从健康的捐赠者以及癌症金额外周血困难患者（图1c，d）项1,4。
在这个协议中，我们演示了如何获取充分激活的人PBMC CD40 - B从细胞。细胞培养的关键分子CD40配体，白细胞介素4（IL - 4）和环孢素A（CsA），这是在3-4天养殖周期的补充。 CD40的刺激对于实验室的目的是提供NIH/3T3细胞表达重组人CD40配体（tCD40L NIH/3T3）5。为了避免污染与非转染的细胞，表达人CD40配体的转染，定期进行检查（图）。
CD40 - B细胞培养，经过14天，包括95％以上的纯B细胞和CD40 - B细胞超过65天的扩张是没有任何损失的功能：1，4经常可能。 CD40 - B细胞的有效占用，过程和目前T细胞抗原6。他们不只有总理naϊve，而且还扩大记忆性T细胞7,8。 CD40激活的B细胞可用于研究B细胞的活化，分化和功能。此外，他们代表一个有前途的治疗或预防接种抗肿瘤9工具。
Protocol
PBMC的人CD40激活的B细胞产生的协议分为两部分：A部分演示NIH/3T3细胞，将用于板约束的饲养层细胞表达CD40配体的准备。 B部分介绍了各种实际的CD40 - B的文化。
A.制备饲养细胞（NIH/3T3 tCD40L）
tCD40L NIH/3T3壁小鼠成纤维细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养，不推荐。
- 从小学文化的老媒体取出，用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。
- 添加4 mL的胰蛋白酶/ EDTA在75厘米的 2瓶5-10分钟，在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。
- 野生型中添加10毫升，并轻轻旋转。
- 转移到50 mL试管细胞悬液，用无菌吸管和旋转5分钟在225 XG细胞。
- 去除上清，重悬沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数，并准备适当数量的细胞50毫升管：
- 1.5 × 10 6细胞传代
- 0.2 × 10 6细胞/孔的CD40 - B细胞培养用于照射
- 其余冻结（如需要）。
- 旋转细胞在225 5分钟XG。
- 去除上清。
- 传代培养：重悬于1.5 × 10 6细胞10毫升，75厘米2细胞培养瓶中的野生型中（细胞密度为1.5 × 10 5细胞/ mL），加入的G - 418 [0.7毫克/毫升]和孵化细胞37℃，5％的CO 2 。每周两次分裂的细胞。
- 对于CD40 - B细胞培养：您需要1.2 × 10 6 6孔板细胞。在野生型中重悬的细胞密度0.1 × 10 6细胞/ mL，他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液，每口井，并在37℃，5％的CO 2。使用B -细胞的刺激，这准备板块tCD40L NIH/3T3细胞是贴壁时（至少4个小时：坚持用显微镜检查;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激）。 （继续与B）
B. CD 40 - B细胞培养
一，制备外周血CD40的刺激（0天）：
请注意：在继续之前确定，饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法白细胞介素4和环孢素A培养基中，使用前。
- 取外周血，新鲜或适当解冻。悬浮外周血1X PBS毫升，两次把它们洗干净，和自旋向下第一时间为7分钟，第二次在7分钟190 XG删除其他细胞在265 XG。弃上清，并在20毫升的PBS重悬细胞。确定细胞的细胞悬液分装数。
- 离心5分钟在225 XG所需的细胞量。对于6孔板4 × 10 6细胞/孔的需要，因此24 × 10 6细胞每盘。
- 去除上清，重悬CD40 - B的文化与50 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的外周血单个核细胞在1 × 10 6细胞/ mL，作为一种生长因子和0.63微克/毫升环孢素A到防止T细胞的产物（给定的浓度是指一毫升培养液）。
- 去除上清从6孔板前培养与tCD40L NIH/3T3细胞。
- 每孔2 mL的PBS第一和第二步在2毫升的CD40 - B的清洗介质，清洗附着tCD40L NIH/3T3细胞。
- 轻轻添加4毫升的外周血单个核细胞悬液（1 × 10 6细胞/ mL），每孔6孔板。
- 细胞在37 ° C的5％的CO 2。
- 第7天，reculture细胞（3.2继续。）
二。复垦的CD40的B细胞（7天，然后每隔3-4天）：
- 从6孔板CD40 - B细胞10毫升到50毫升管的移液器和池他们resuspending收获集群。
- 离心7分钟在225 XG，并完全取代CD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分，5分钟旋转225 XG细胞。悬浮CD40的B细胞CD40 - B的培养基中，在浓度为1 × 10 6细胞/ mL 。
- 在50 U / mL的浓度和0.63μg/ mL的环孢素A的中期添加新鲜的白细胞介素4的解决方案。
- 从6孔板与tCD40L NIH/3T3细胞预孵育取出上清。
- 每孔2 mL的PBS第一和第二步在2毫升的CD40 - B的清洗介质清洗贴壁细胞。
- 孵育板在37℃，5％的CO 2。
- 再次传代培养细胞每隔3-4天，结束与高纯度的人CD40 B细胞激活后，共14天。
C.故障排除 - CD40 - B细胞，如果不增长？
- 你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达？
- 板势必给料机，用于刺激细胞不应超过24h以上吗？
- 支原体可能是一个污染？
- 白细胞介素4的解决方案，为补充新鲜解冻，并有适当的生物活性？
- 环孢素A中添加正确的浓度？
图1，请点击这里为图1的放大版本。
图2，请点击这里为图2的较大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| G-418 (0.7 mg/mL) | |||
| 3. CD40-B washing medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 4. CD40-B culture medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| rh Transferrin (50 μg/mL) | |||
| rh Insulin (5 μg/mL) | |||
| AB-Humanserum (10%) | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| DMEM / Ham’s F12 | PAA Laboratories | Cat No: E15-813 | |
| IMDM | Invitrogen | REF 21980-032 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 | |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | Cat No T0665 | |
| Insulin human | Sigma-Aldrich | Cat No I2643 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| G-418 Sulphate | PAA Laboratories | Cat No P02-012 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
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- Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
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- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).
