Biology

Поколение прав CD40 активированных В-клеток

Published: October 16, 2009 doi: 10.3791/1373

Tanja M. Liebig¹, Anne Fiedler¹, Shahram Zoghi¹, Alexander Shimabukuro-Vornhagen¹, Michael S. von Bergwelt-Baildon¹

¹Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

Summary

В этом видео мы представляем

Abstract

CD40 активированных В-клеток (CD40-лимфоцитов) были определены в качестве альтернативного источника иммуно-стимулирующего антиген-представляющих клеток (АПК) для иммунотерапии рака ^1-3. По сравнению с дендритные клетки (ДК), лучше всего характеризует APC, CD40-лимфоцитов иметь несколько различных биологических и технических свойств. Как и в DC, В-клетки показывают повышенную экспрессию МНС и костимулирующих молекул (рис.1б), проявляют сильный миграционный потенциал и настоящее презентации антигена эффективно Т-клетки, после стимуляции интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L). Однако, в отличие от незрелых или зрелых ДК, CD40-B клетки экспрессируют полный лимфатических узлов самонаведения триаду, состоящую из CD62L, CCR7/CXCR4 и лейкоцитов функции антиген-1 (LFA1, CD11a/CD18), необходимых для наведения на вторичных лимфоидных органах (рис. 1а) ^3. CD40-B клетки могут быть получены без трудностей от очень небольших количествах периферической крови, которая может быть расширена в пробирке до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10 ^{9 клеток} на одного пациента) от здоровых доноров, а также рака пациентов (Fig.1c, г) ^1,4.

В этом протоколе мы покажем, как получить полностью активирована CD40-В-клетки из человеческой РВМС. Основные молекулы, для культуры клеток являются CD40 лиганд, интерлейкин-4 (ИЛ-4) и циклоспорин (CSA), которые пополняются в 3-4 цикла культура день. Для лабораторных целей CD40 стимуляции обеспечивается NIH/3T3 клеток, экспрессирующих рекомбинантный человеческий CD40 лиганд (tCD40L NIH/3T3) ^5. Во избежание загрязнения с неправительственными организациями, трансфицированных клеток, экспрессию человеческого CD40 лиганда на трансфектантов должен регулярно проверяться (рис.2).

После 14 дней CD40-B культурах клеток состоят из более чем 95% чистой клеток и расширение CD40-B клеток в течение 65 дней часто удается без потери функции ^{1, 4.} CD40-В-клеток эффективно заниматься, обработки и представления антигенов Т-клеток ^6. Они не только простые naϊve, но и расширяют ячеек памяти T ^7,8. CD40 активированных В-клеток может быть использована для изучения В-клеточной активации, дифференцировки и функции. Более того, они представляют собой перспективный инструмент для использования в терапевтических или профилактических прививок против опухолей ^9.

Protocol

Протокол для поколения человеческие CD40 активированных В-клеток РВМС делится на две части: часть демонстрирует подготовку CD40 лиганд выражения NIH/3T3 клетки, которые будут использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерные клетки. Часть В описывает фактические CD40-B культуры.

А. Подготовка фидерных клеток (tCD40L NIH/3T3)

TCD40L NIH/3T3 является сторонником мышиной линии клеток фибробластов, которые никогда не должны стать полностью вырожденная. Клетки, таким образом, разделил два раза в неделю. Культивирование в течение более 6 недель не рекомендуется.

Удалить старые среды от первичной культуры с стерильной пипетки и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте PBS после мытья.
Добавить 4 мл трипсина / ЭДТА в 75 см ² колбы в течение 5-10 минут при температуре 37 ° C. Используйте нежное нажмите, чтобы отделить клетки.
Добавьте 10 мл дикий тип среды и поворота мягко.
Передача клеточной суспензии в 50 мл трубки с стерильной пипетки и спина ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 мин.
Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл дикий тип среды. Граф количества клеток аликвоту суспензии клеток и подготовить три 50 мл трубки с соответствующим количеством клеток:
1. 1,5 х 10 ⁶ клеток для субкультивирования
2. 0,2 х 10 ⁶ клеток / лунку для облучения используется для CD40-B культуре клеток
3. Остальная заморозить (при необходимости).
Спиновые ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 мин.
Удалить супернатант.
1. Для субкультивирования: ресуспендирования 1,5 х 10 ^{6 клеток} в 10 мл дикий тип среды в 75 см ² колбы культуры клеток (плотность клеток 1,5 х 10 ⁵ клеток / мл), добавить G-418 [0,7 мг / мл] и инкубировать клеток 37 ° C с 5% CO _2. Сплит клетки два раза в неделю.
2. Для CD40-B культуре клеток: Вам нужно 1,2 х 10 ^{6 клеток} на один 6-луночный планшет. Ресуспендируют клеток в дикой среде типа с плотностью 0,1 х 10 ^{6 клеток} / мл и облучать их на 78 Гр. Пластина 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать их при температуре 37 ° C с 5% CO _2. Используйте этот подготовленные пластины для В-клеток при стимуляции tCD40L NIH/3T3 клетки приверженцем (по крайней мере 4 часа: проверять соблюдение с микроскопа, не ждать более 24 ч до начала В-клеточной стимуляции). (Продолжить с Б.)

Б. CD, 40-Б культуре клеток

I. Подготовка МНПК для стимуляции CD40 (день 0):

Обратите внимание: перед тем как продолжить констатировать, что фидерных клеток являются приверженцем. Всегда добавляйте свежие решения интерлейкина-4 и циклоспорина в питательную среду непосредственно перед употреблением.

Возьмите МНПК, либо свежие или надлежащим образом талой. Ресуспендируют МНПК дважды в 50 мл 1 раз PBS, чтобы вымыть их и со спином вниз впервые на 265 мкг в течение 7 минут, а второй раз при 190 мкг в течение 7 минут, чтобы удалить другие клетки. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 20 мл PBS. Определить номер ячейки в аликвоту клеточной суспензии.
Спином вниз необходимое количество клеток в 225 мкг в течение 5 мин. Для 6-луночный планшет 4 х 10 ⁶ клеток / лунку необходимо, таким образом, 24 х 10 ^{6 клеток} на чашку.
Удалить супернатант и ресуспендируйте РВМС на 1 х 10 ^{6 клеток} / мл в CD40-B культуральной среде недавно дополнена с 50 ЕД / мл интерлейкина-4 в качестве фактора роста и 0,63 мкг / мл циклоспорин для предотвращения результатом Т-клеток (С учетом концентрации относятся к одной среды культуры мл!).
Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с tCD40L NIH/3T3 клеток.
Вымойте приверженцем tCD40L NIH/3T3 клеток с 2 мл PBS на лунку первом и во втором шаге 2 мл CD40-B средний стирки.
Аккуратно добавить 4 мл РВМС подвески (1 х 10 ⁶ клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO _2.
На 7-й день, reculture клеток (Продолжить 3.2.).

II. Рекультивация CD40-лимфоцитов (7-й день, а затем каждые 3-4 дня):

Урожай кластеров CD40-лимфоцитов из 6-луночный планшет по ресуспендированием с 10 мл пипетки и бассейном их в 50 мл трубки.
Спином вниз на 225 мкг в течение 7 минут и полностью заменяют собой супернатант с CD40-B средний стирки. При подсчете количества ячейки аликвоту, спина ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 минут. Ресуспендируют CD40-клеток в CD40-B культуральной среде при концентрации 1 х 10 ^{6 клеток} / мл.
Добавить свежие решения интерлейкина-4 в концентрации 50 ЕД / мл и 0,63 мкг / мл циклоспорин в среду.
Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с tCD40L NIH/3T3 клеток.
Вымойте прилипшие клетки с 2 мл PBS на лунку первом и во втором шаге 2 мл CD40-B средний стирки.

6 клеток / мл) CD40-B подвески в каждую лунку 6-луночный планшет.

Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO ^2.

Субкультура клетки снова каждые 3-4 дней, чтобы закончить с высокой чистоты человеческого CD40 активированных В-клеток после общей сложности 14 дней.

C. Устранение неисправностей - Что делать, если CD40-B клетки не растут?

Проверяли ли Вы для CD40 лиганд выражение фидерных клеток?
Пластинчатых связаны фидерные клетки используются для стимуляции не должны быть старше 24 часа?
Является ли загрязнение микоплазмой возможно?
Был интерлейкина-4 раствор, используемый для добавки свежей талой и имел соответствующее биологической активности?
Был циклоспорина добавили в правильной концентрации?

Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения фигуры 1.

Рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:

DMEM / Ham’s F12	PAA Laboratories	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	Cat No T0665
Insulin human	Sigma-Aldrich	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis AG	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA Laboratories	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA Laboratories	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:

Sterile pipette tips	Sarstedt Ltd
6-well plate	Nalge Nunc international	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Biosciences	Cat No 352070
Tissue culture flask	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002