Summary
En steg-för-steg guide för att skapa riktade chimär zebrafisk embryon genom transplantation vid blastula eller gastrulastadium.
Abstract
En av de mest kraftfulla verktyg som används för att få insikt i komplexa utvecklingsprocesser är analysen av chimära embryon. En chimär definieras som en organism som innehåller celler från mer än ett djur, mosaiker är en typ av chimera där celler från mer än en genotyp är blandade, oftast vildtyp och mutant. I zebrafisk kan chimärer lätt göras av transplantation av celler från en donator embryo till en värd embryo vid lämplig fosterstadiet. Märkta donator celler skapas genom injektion av en härstamning markör, t.ex. en fluorescerande färg, i en-cells stadiet embryo. Märkta donator celler avlägsnas från givare embryon och förs in omärkta värd embryon med hjälp av en olje-kontrollerad glaspipett monterade på antingen en förening eller dissekera mikroskop. Donator celler kan i vissa fall riktas till en viss region eller vävnad av utvecklingsländerna blastula eller gastrula stage värd embryo genom att välja en transplantation plats i den mottagande embryot baserade på väletablerade öde kartor.
Protocol
En steg-för-steg guide för att skapa riktade chimär zebrafisk embryon genom transplantation vid blastula eller gastrulastadium.
En av de mest kraftfulla verktyg som används för att få insikt i komplexa utvecklingsprocesser är analysen av chimära embryon. En chimär definieras som en organism som innehåller celler från mer än ett djur, mosaiker är en typ av chimera där celler från mer än en genotyp är blandade, oftast vildtyp och mutant. I zebrafisk kan chimärer lätt göras av transplantation av celler från en donator embryo till en värd embryo vid lämplig fosterstadiet. Märkta donator celler skapas genom injektion av en härstamning markör, t.ex. en fluorescerande färg, i en-cells stadiet embryo. Märkta donator celler avlägsnas från givare embryon och förs in omärkta värd embryon med hjälp av en olje-kontrollerad glaspipett monterade på antingen en förening eller dissekera mikroskop. Donator celler kan i vissa fall riktas till en viss region eller vävnad av utvecklingsländerna blastula eller gastrula stage värd embryo genom att välja en transplantation plats i den mottagande embryot baserade på väletablerade öde kartor.
Del 1: Injektion Zebrafish Embryon vid 1-cell skede.
- Enzymatisk dechorionation av 1-cell stadium embryon.
För att proteolytically dechorionate embryon, inkubera vid 1-cell scen för ~ 1-5 "i en 0,5 mg / ml pronase lösning som beskrivs i Zebrafish bok 1. Moniter dechorionation noga och dränka embryon i embryon Medium (EM) med penna / Strep 1 så snart chorions börjar synbart kollaps. När frigörs från sina chorions, blastula och gastrulastadium embryon är ömtåliga och kommer att hålla fast plast eller splittras om de utsätts för luft. Därför håller dechorionated embryon nedsänkt i Penna / Strep EM, överföring mellan rätter med ett brett bar brand-polerat glas pipett och underhålla i antingen agar-belagd plastskålar (1,2% agaros i Penna / Strep EM) eller autoklaveras glas petriskålar. - Injektion dechorionated embryon med härstamning markör.
Förbered en injektion maträtt genom att sätta in en glasskiva i 45 graders vinkel över den bredaste delen av en petriskål tre fjärdedelar full med 1,2% agaros gjorts i Penna / Strep EM. Borttagning av bild efter agarosen stelning lämnar en fasad tråg. Överför dechorionated embryon till tråg av en injektion skål fylld med penna / Strep EM. Injicera 1nl volymer av härstamning markör med hjälp av en exakt kalibrerad brand drog pipett glas injektion och ett tryck injektion riggen, som beskrivs i Zebrafish bok 1. Injicera färgämnen och låg molekylvikt spårämnen härstamning direkt i äggulan i dechorionated embryon mellan 1 - och 4-cells steg. En 3% lösning av fluorescerande dextran är tillräckliga för att möjliggöra upptäckt av givare-härledda celler i chimär embryon genom flera dagar av utveckling. När härstamning markören är en mRNA som kodar för ett fluorescerande protein (till exempel, GFP eller RFP), injicera direkt in i cellen av de tidiga 1-cell skede embryo. - Injektion icke-dechorionated embryon med härstamning markör.
Förbered flera bra injektion rätter med stelnar 1,2% agaros i EM runt en form med brunnar ungefär samma bredd som chorion diameter. Överföring icke-dechorionated embryon till en flera bra injektion maträtt hälften fylld med Pen / Strep EM. Ta bort överflödig vätska. Således immobiliserade kan embryon injiceras med 1nl volymer härkomst markör som beskrivs ovan. - Höja injiceras embryon för transplantation.
Höj embryon vid låg densitet (40-50 embryon per fat) i färskt Penna / Strep EM. Stage-match givaren och värd embryon som används för transplantation ganska noga. För sköld skede transplantationer, sikta på givarna till något släpa efter värdar, notera att injiceras embryon tenderar att vara något fördröjd. Inkubera embryon vid olika temperaturer, 25 ° C, 28 ° C och 31 ° C, att sprida deras utveckling och maximera tidsfönstret under vilken transplantationer kan utföras.
Del 2: Att göra chimär zebrafisk embryon genom transplantation.
- Transplantation vid blastula steg på stereomikroskop
- Beskrivning av transplantation riggen för blastula
Den apparat som används för celltransplantation i zebrafisk blastula består av en mikrometer drive-styrda Hamilton spruta (10 l-50 l) fäst med en trevägskran till en reservoar av mineralolja och att en mikropipett innehavaren genom en längd på flexibel slang . Efter montering av transplantation riggen, den är fylld med mineralolja, noga med att eliminera alla luftbubblor ur systemet. Närvaron av en luftbubbla kommer att negativt påverka din förmåga att kontrollera ee sug och tryck. Använd ett stereomikroskop med ganska hög förstoring och bra optik (helst minst 80x förstoring). Placeringen av mikropipett innehavaren och nålen kan styras av en Narishige manuell mikromanipulator, som för injektioner, men om basen på stereoskopet är för bred för att ge enkel tillgång till mikromanipulator, då en adapter som ansluts till kropp stereomikroskop kan också köpas från Narishige. Montering av mikromanipulator måste vara mycket stabilt för att undvika att överföra vibrationer till transplantation nålen, en magnetisk bas fungerar bra för detta ändamål. - Förbereda transplantation pipett
Transplantation nålar är tillverkade av glas kapillärpipett (se två alternativ i reagens tabellen nedan) att dras till en skonsam nedtrappning på en elektrod avdragare. Bryt toppen av kanylen från under ett dissekera mikroskop med hjälp av en rak rakblad vid den punkt där den inre diametern av nålen är något större än de celler som ska transplanteras. Håll rakblad i en liten vinkel för att skapa en avfasning och göra paus så smidigt som möjligt, utan ojämna kanter. För blastula skede transplantationer ytterdiametern av nålen ska mäta ca 50-60 mm. - Montering embryon för transplantation agar formar
Förbered injektion rätter av flytande en plastform med rader av kilformigt utsprång i en petriskål som är till hälften fylld med smält 1,2% agaros i EM. När agarosen stelnat, ta bort mallen och lämnar ett agar mögel som innehåller rader av triangeldelning formade brunnar var precis stor nog att rymma ett embryo. Fyll transplantation mögel med penna / Strep EM och ladda blastula skede embryon individuellt i varje brunn med en brand polerat glas pipett så att blodgivaren embryona placeras ner en kolumn och den mottagande embryona placeras ned den intilliggande kolumnen. - Transplantera celler
Placera embryon i transplantatet brunnar på sina sidor; flytta med transplantationen pipetten som behövs under transplantationen noga med att inte punktera den äggula. Placera skålen på scenen så att när transplantation nålen går in i ett embryo, skjuter nålen embryot mot den bakre väggen i sitt väl. Använda mikromanipulator, lägre transplantation nålen i skålen på en tämligen brant vinkel. Helst transplantation nålen in i embryot ungefär ett 45-graders vinkel. När nålspetsen ligger under ytan av embryot medium, dra en liten mängd embryo medium i nålen genom att vrida på mikrometer-enheten kontrollerar Hamilton sprutan. För den mest exakta kontroll bör gränssnittet mellan mineralolja och embryot mediet kvar i den tunna, avsmalnande delen av nålen, men inte för nära slutet. Försiktigt placera givaren embryot med nålen och sedan dra nålen tillbaka och ange blastula locket på embryot till önskad position. En snabb, hårt penetrerar embryot utan att det att rulla. Upprätta donator celler långsamt och försiktigt in nålen. Om cellerna tas upp för snabbt, kommer de sannolikt att klippa. Undvik också att ta äggula upp i nålen, eftersom det kommer att binda till mineralolja, som sedan kommer att döda cellerna. Efter önskat antal celler tas upp, vända på trycket något för att stoppa sug och ta bort nålen från embryot. Ta värd embryot på plats genom att flytta transplantation skålen. Små justeringar av positionen i den mottagande embryot kan göras genom att försiktigt vrida den med hjälp av transplantation nålen, så länge man är försiktig att inte röra äggula. När utvisa givaren cellerna i den mottagande embryot, undvika att införa en stor mängd embryo medium eller någon mineralolja, eftersom det kan störa utvecklingen eller döda embryot. Placeringen av celler längs djur-växt-axeln påverkar deras bidrag till en av de tre groddblad, endoderm, mesoderm och ektoderm 2,3. Följaktligen kommer celler transplanteras nära marginalen före början av gastrulation ge upphov företrädesvis endoderm och mesoderm, medan celler transplanterade mot djuret polen kommer att bidra till ektodermal öden, oftast yta ektoderm, framhjärnan och ögon. Således en viss vävnad inriktning kan ske även vid blastula stadier. När cellen överföringarna har genomförts, överföring givaren-host par till agar brunnarna på en 24 brunnar att utveckla ytterligare.
- Transplantation vid gastrula långt på det sammansatta mikroskopet
- Beskrivning av transplantation riggen
Cell överföringar som utförs på ett sammansatt mikroskop nytta av exakt kontroll av nålposition tillhandahålls av en treaxlig oljehydraulikmikromanipulator. Detta mikromanipulator kontrollerar fina rörelser transplantation pipett, medan sug i pipetten styrs av en mikrometer-drive Hamilton spruta liknar den som används för blastula transplantationer. En upprätt sammansatt mikroskop med en fast fas är att föredra för att utföra cell överföringar sedan fokusera sådant mikroskop orsakar inte embryot att flytta förhållande till pipett. Men om en justerbar steg sammansatt mikroskop måste användas, då mikromanipulator kan monteras på scenen snarare än till kroppen av mikroskop med samma effekt. Adaptrar som erbjuder alternativ för montering av mikromanipulator antingen till stadium eller organet av sammansatt mikroskop från olika tillverkare är också tillgängliga från Narishige. - Förbereda transplantation pipett
Transplantation nålar görs i huvudsak enligt ovan, för gastrulastadium transplantationer den perfekta nålen bländaren är 30-40 mm. Efter sköld formation blir omslutande skikt (EVL) fler anhängare, vilket gör det svårt för transplantation nålen att tränga in i embryot. För att underlätta nål posten, dra en hulling i änden av nålen med hjälp av en microforge. Först jämna nålspetsen genom att den nära glödtråden i microforge, vrid nålen så att framkanten av avfasning kan få kontakt med glödtråden. När framkanten av nålen i kontakt med glödtråd, drar det snabbt iväg för att skapa en hulling, eller harpun. För att undvika att skada celler bör hulling vara rak och nålspetsen bör inte kurvan - Montering embryon för transplantation i metylcellulosa
För transplantation sammansatt mikroskop, montera embryon på en depression bild i en 3% lösning av metylcellulosa (Sigma) löst i embryo medium. Först smeta en vertikal rand av metylcellulosa i depression av ett glas depression bild, sedan översvämning med en generös mängd embryo medium. Med hjälp av en brand-polerat pipett överföra en donator och tre sköld steg värdar under ytan i EM på depression glida på ena sidan av metylcellulosa. Välj givare embryon som är något yngre än de värdar (30-50% epiboly). Med en liten ögla som framställts genom limning ändarna på en kort längd på 2-lb provfiske linje i slutet av ett kapillärrör, försiktigt rulla givaren och värd embryon upp på toppen av metylcellulosa band och grejer dem ner i metylcellulosa ordentligt. Om de transplanterade cellerna att vara inriktad på en viss domän, kunskap om skölden scenen öde karta 3,4 och placeringen av målvävnaden förhållande till skölden är nödvändig för att vara värd embryon kan placeras korrekt. Som värd embryona placeras i metylcellulosa, rulla dem på plats så att den riktade regionen är uppåt, eftersom under transplantationen nålen kommer in i embryot tangentiellt att leverera givaren cellerna utan att skada äggula. - Transplantera celler
Placera transplantation nålen genom att flytta den i fokalplan embryot. Först fokuserar på donatorns embryot med 10x objektiv. Flytta sedan embryot åt sidan, och utan att justera fokalplanet, använda kontrollerna av mikromanipulator att få toppen av transplantation nålen i fokus. Placera mikropipett innehavaren och nålen på en ganska flack vinkel, så att nålen är så nära vågrätt som kanten av depression i bilden tillåter. Om ett embryo är monterad på rätt sätt i metylcellulosa, kommer det rulla inte lika transplantationen nålen går in, om inte embryot är för gammal för att låta nålen att tränga in lätt. Den omslutande skikt tycks skärpa som embryon ålder, därför är gastrulastadium transplantationer bäst utförs direkt efter sköld bildas. Efter kupolen skede bor äggulan knappt cellerna i BLASTODERM mössa, som successivt tunnar som epiboly vinning. För att undvika piercing äggulan, bör nålen in i embryot till en central plan som är bara något djupare än EVL. När du tar bort ett stort antal celler från donatorn embryot, flytta nålen runt som cellerna tas upp, för att undvika misstag suger äggula in nålen. Om celler från en givare embryo som ska transplanteras till flera värdar, är det bäst att gå in givaren med nålen bara en gång för att minimera risken för skador. Givaren cellerna kan sedan överföras till önskad plats i upp till tre värd embryon. Vid överföring av celler från två eller fler givare embryon till en värd embryo är det bäst att ta celler från varje donator embryon till samma transplantation nålen innan transplantera dem till en värd embryo. Detta minimerar skador till värden embryot, och ser till att de celler överförs till samma område av embryot, så att deras beteenden kan jämföras. Mycket lite blandning ocljudupptagningarna mellan givaren celler i transplantatet nål, därför bör de celler som skall överföras till en enskild värd när mer än en givare används. För att öka sannolikheten för att givaren cellerna kommer att bidra till den önskade vävnaden, utesluta givaren celler medan nålen drogs genom målområdet, i motsats till insättning cellerna i en enda klump. När cellen överföringarna är klara, placera hela bilden i en petriskål och översvämningar noga med penna / Strep EM. Under de närmaste timmarna metylcellulosa kommer att upplösas, släppa embryon.
Figur 1: Mikroskop set-up för att göra chimär embryon. A: En dissekera mikroskop transplantation rigg består av en oljefyllda Hamilton spruta med en mikrometer enhet (a) är ansluten till en oljefylld behållare (b) och transplantation pipett (c) via en 3-vägs kran (d). Transplantationen pipetten är monterad på en grov mikromanipulator (e) som är knuten till en metallplatta (visas inte) via en magnetisk fot (f). Transplantation utförs på scenen i ett stereomikroskop (g) utrustade med botten belysning för optimal optik. B: ett sammansatt mikroskop transplantation rigg består av en liknande oljefyllda Hamilton spruta och mikrometer-enhet (a, b) men i detta fall transplantationen pipetten är monterad på en pipett hållare (c) vars X, Y och Z rörelser kan styras antingen genom en grov (d) eller fin (e) mikromanipulator. I det här exemplet är mikromanipulator monterad på kroppen av en fast fas mikroskop, men det är också möjligt att montera den på scenen i ett vanligt mikroskop. De embryon som är immobiliserade på metylcellulosa på en depression bild visualiseras med hjälp av ett 10x objektiv (f). C: Transplant mögel för immobilisera embryon för stereomikroskop transplantationer. Dechorionated embryon släpps individuellt i brunnar görs genom gjutning denna mögel i agaros i en 90mm petriskål. Måtten av brunnarna visas.
Figur 2: Montering embryon för gastrula steg transplantationer. A: ideal form av en gastrula transplantation pipett. En avfasning med en vass spets stöd i att tränga in i embryot. B: immobilisera givare och värd embryon i metylcellulosa. En remsa av metylcellulosa fastställs i brunnen av en depression bild och översvämmad med en generös mängd embryo medium. Embryon läggs till i embryot medium och rullas in på metylcellulosa med en liten ögla (C). GD Utvidgning av embryon i bild. 1B. D: Givaren embryot är orienterad så att lättast tillgång till pipetten, eftersom cellerna i det här skedet är fortfarande obekräftade. EG: Shield-stegs värd embryon är orienterade så att målet regionen uppåt. Celler transplanteras in den inramade områden kommer att bidra till rygg hindbrain och kraniella neural crest härstammar från vänster (E) och höger (G) sidor eller till ventrala hindbrain och ryggmärgen (F).
Figur 3: Representant bilder av chimär embryon.
(AC) 18hpf chimär embryon som genereras av transplantation på sköld skede visas i rygg uppfattning främre till vänster. (A, B) Sortering funktioner för cellytan receptor EphA4 avslöjas genom analys av chimär embryon. Vänster panel: sammanslagning av Rhodamine märkt (rhod.) donator celler (röd) och transgena GFP uttryckt i specifika hindbrain segment (grön). (A) WT celler bidrar till hela hindbrain av en kontroll chimär embryo. (B) EphA4-utfiskade donator celler är undantagna från specifika segment i hindbrain en WT värd. (C) Donor celler riktade mot olika delar av neuralrörsdefekter i sköld-stegs transplantationer. Donator celler (röd) riktade till framhjärnan / mitthjärnan (till vänster) eller hindbrain / ryggmärgen (högra panelen) av en WT värd counter-färgat med ett EfnB2a antikropp som markerar framhjärnan, mitten hindbrain gränsen och mitten delen av hindbrain (grön). Skala barer: 50μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den lätthet med vilken transplantation kan användas till att utarbeta målinriktad chimärer är en av stormakterna i zebrafisk som ryggradsdjur modell. En ändring av detta protokoll inte beskrivs ovan möjliggör analys av moderns geners funktion för att gener med viktiga roller i zygotic utveckling. Eftersom dessa muterade fiskar inte kan överleva till vuxen ålder, är det nödvändigt att överföra muterade könsceller in i en annars vildtyp värd embryo, skapa "könsceller kloner" av muterade celler. Generera könsceller mosaik innebär transplantation ursprungliga könsceller från en mutant givare till ett wild-type värd embryo. Till skillnad från alla andra cell linjer i embryot, är fröet cellsläktträd anges mycket tidigt i utvecklingen av det arv av moderns bestämningsfaktorer 5,6. Således är den första utmaningen att göra könsceller mosaiker identifiera de ursprungliga könscellerna (PGCs) i givaren embryot. Vid midblastula iscensätter PGCs bor längs marginalen 7,8, så plocka upp 50-100 slumpmässiga celler från marginalen i en släkt märkt givare embryo ofta resulterar i överföringen av PGCs. När överförs till djur polen en omärkt värd embryot, primordial könsceller vandrar aktivt mot presumtiva gonad där de entydigt kan identifieras efter 24 timmar av utveckling av sina karaktäristiska position, storlek och färg retention på grund av deras långsamma proliferativa takt 9-11. Samtidigt donator-derived icke-PGCs förvärvar öde avgörs av deras placering i den mottagande: främst framhjärnan och ögon om de transplanteras till blastula djuret polen. Injektion värden embryo med morpholinos att slå ner återvändsgränd genen effektivt eliminera värd könsceller i en cell-självständigt sätt, så att även en enda givare som härrör PGC kan återbefolka hela könsceller 10,12 (CM, personlig observation). På senare tid har en transgen linje som gör att PGCs ska visualiseras i levande embryon under blastula steg tagits fram 13. När korsade in den muterade vars mödrar funktion ska bestämmas, kommer detta transgenen i kombination med den återvändsgränd morpholinos gör könsceller transplantationer facile eftersom enda PGCs kan identifieras och transplanteras till en könsceller-utarmat värd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Tack vare medlemmarna i Moens labb för bra insatser under skrivandet av denna artikel. HK är forskarassistent stöds av NIH / NICHD bevilja # 5R01HD037909-08. CBM är en utredare med Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
|||
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
