Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Очистка Митохондрии из дрожжей Клетки

Published: August 24, 2009 doi: 10.3791/1417
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

Мы описываем быстрым и эффективным методом для очистки от митохондрий дрожжей

Abstract

Митохондрии являются основным местом производства АТФ во время аэробного метаболизма в эукариотических без фотосинтезирующих клеток

Protocol

Материалы и методы

Штаммов дрожжей и условий роста

Штамма дикого типа BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) был выращен в богатой среде YEPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% глюкозы). Клетки культивировали при 30 ° С с вращательными встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в колбах Эрленмейера на "колбе объем / средний объем" отношением 5:1.

Изоляция сырой митохондриальной фракции

  1. Расти 1 л дикого типа культуры BY4742 напряжение в течение 48 ч.
  2. Налейте культуры в 500-мл пробирки Nalgene центрифуги. Баланс нагрузки и урожай клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  3. Декантировать супернатант и гранулированный ресуспендирования клеток в 250 мл dH2O. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  4. Декантировать супернатант и гранулированный ресуспендирования клеток в 250 мл dH2O. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  5. Определить живого веса осадок клеток.
  6. Ресуспендируют гранулированных клеток в DTT буфера [2 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
  7. Передача клеточной суспензии до 50-мл пробирки Сокол пластика.
  8. Поворот трубы на 70 мин в шейкере в течение 20 мин при 30 ° С.
  9. Урожай клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  10. Ресуспендируют гранулированных клеток в Zymolyase буфера без Zymolyase [7 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
  11. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  12. Ресуспендируют гранулированных клеток в Zymolyase буфера без Zymolyase [7 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
  13. Передача клеточной суспензии в стеклянную колбу.
  14. Добавить порошок Zymolyase-100Т [1 мг Zymolyase-100T / г (сырого веса) клетки] для клеточной суспензии.
  15. Поворот колбу с клеточной суспензии при 70 мин в шейкере в течение 30 мин при 30 ° С.
  16. Передача сферопластов формируется за счет переваривания клеточной стенки с Zymolyase-100T в 50-мл пластиковые трубки центрифуги.
  17. Гранул сферопластов центрифугированием в течение 8 мин при 2200 мкг при 4 ° C.

** Все последующие шаги должны проводиться при температуре 4 ° С или на льду. Суспензии сферопластов следует обращаться осторожно использованием пипетки с вырезом советов, чтобы избежать нарушения органелл .**

  1. Ресуспендируют гранулированный сферопластов в ледяной гомогенизации буфера [6,5 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
  2. Гранул сферопластов центрифугированием в течение 8 мин при 2200 мкг при 4 ° C.
  3. Ресуспендируют гранулированный сферопластов в ледяной гомогенизации буфера [6,5 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
  4. Передача клетки предварительно охлажденные на льду стеклянного гомогенизатора.
  5. Использование жесткой пестиком, гомогенизации клетки, делая 15 ударов пестиком.
  6. Добавить 1 объем ледяной гомогенизации буфера.
  7. Передача гомогенизированный сферопластов в 50-мл пластиковые трубки центрифуги.
  8. Гранул непрерывно клетки, ядра, и крупные обломки центрифугированием в течение 5 мин при 1500 мкг при 4 ° C.
  9. Центрифуга Полученный супернатант в течение 5 мин при 3000 мкг при 4 ° C.
  10. Центрифуга Полученный супернатант в течение 15 мин при 12000 мкг при 4 ° C.
  11. Декантировать супернатант и ресуспендируйте гранул в ледяной буфера гомогенизации [6,5 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
  12. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при 4 ° C.
  13. Центрифуга Полученный супернатант в течение 15 мин при 12000 мкг при 4 ° C.
  14. Декантировать супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ледяного буфера SEM.

** Хотя эта приостановка обогащается в митохондриях, он также содержит другие органеллы, такие как эндоплазматическая сеть (микросом), Гольджи и вакуоли. Чтобы получить чистую митохондрии, этой грубой митохондриальной фракции могут быть подвергнуты дальнейшему фракционирования, как описано ниже .**

Очистка митохондрий лишенный загрязнения другие органеллы

  1. Место 1,5 мл ледяной 60% (вес / объем) сахарозы в EM буфера в Бекман Ultra-Очистить центрифуге трубки.
  2. Overlay 60% (вес / объем) сахарозы с 4 мл 32%, 1,5 мл на 23%, 1,5 мл 15% сахарозы (все веса в / в в EM буфера).
  3. Место 3 мл сырой митохондриальной фракции в SEM буфера на вершине 15% (вес / объем) сахарозы.
  4. Центрифуга в Бекман SW41 Ti-размахивая ведром ротора течение 1 ч при 134 000 мкг (33000 оборотов в минуту) при 4 ° C.
  5. Интактных митохондриях форме бурой полосой на 60% / 32% сахарозы интерфейс.
  6. Осторожно снимите сахарозы до достижения митохондриальной группы.
  7. Удалить митохондриальной группы с помощью пипетки с разрезом наконечник и поместить его в трубочку центрифуги Beckman для MLS-5 ротора.
  8. Заполните трубку с буфером SEM.
  9. Гранул чистого митохондрий с помощью центрифугирования в MLS-5 ротора в течение 30 мин при 10000 мкг (31000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C.
  10. Декантировать супернатант использованиемпипетки.
  11. Используйте чистую митохондрии для анализа митохондриальной функции, митохондриальная протеома и lipidome и митохондриальной ДНК.

Реагенты

  1. DTT буфера [100 мМ Tris/H2SO4 (рН 9,4), 10 мМ дитиотреитол] (на 15 мл)
    • 1,5 мл 1 М Tris/H2SO4 буфера (рН 9,4)
    • 150 мкл 1 М ДТТ
    • Тома до 15 мл
  2. Zymolyase буфере [20 мМ фосфата калия (рН 7,4), 1,2 М сорбит] (на 100 мл)
    • 2 мл 1 М фосфатного буфера калия (рН 7,4)
    • 60 мл 2 М сорбит
    • Тома до 100 мл
  3. Гомогенизация буфере [10 мМ Tris / HCl (рН 7,4), 0,6 М сорбит, 1 мМ ЭДТА, 0,2% (м / о) BSA] (на 250 мл]
    • 2,5 мл 1 М Трис / HCl буфером (рН 7,4)
    • 75 мл 2 М сорбит
    • 500 мкл 500 мМ ЭДТА
    • 0,5 г BSA
    • Тома до 250 мл
  4. SEM буфере [10 мМ MOPS / КОН (рН 7,2), 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА] (на 250 мл)
    • 2,5 мл 1 MOPS М / КОН буфером (рН 7,2)
    • 31,25 мл 2 М сахарозы
    • 500 мкл 500 мМ ЭДТА
    • Тома до 250 мл
  5. Е. М. буфере [10 мМ MOPS / КОН (рН 7,2), 1 мМ ЭДТА] (на 250 мл)
    • 2,5 мл 1 MOPS М / КОН буфером (рН 7,2)
    • 500 мкл 500 мМ ЭДТА
    • Тома до 250 мл

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот метод позволяет высокодоходные выделения чистых митохондрий из клеток дрожжей. Митохондрии очищают этот метод в основном свободны от загрязнения другие органеллы и сохраняют свою структурную и функциональную целостность после их очистки. Описанный метод дает митохондрий, которые подходят для бесклеточных восстановление основных митохондриальных процессов. Эти высокой чистоты митохондрий также может быть использован для анализа митохондриальной структуры и функций, митохондриальная протеома и lipidome и митохондриальной ДНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами CIHR и NSERC Канады. VIT является следователь CIHR Новые и Concordia University исследований кафедры геномики, клеточной биологии и старения.

References

  1. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).
  2. Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
  3. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  4. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
  5. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
  6. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120, 483-495 (2005).

Tags

Клеточной биологии выпуск 30 субклеточном фракционирования органелл органеллы очистки митохондрии
Очистка Митохондрии из дрожжей Клетки
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko,… More

Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of Mitochondria from Yeast Cells. J. Vis. Exp. (30), e1417, doi:10.3791/1417 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter