Summary
Техника, необходимые для визуализации бьющееся сердце в личинок и взрослых
Abstract
Protocol
Перед тем как начать
Взрослые сердца
- Недавно подготовить искусственные гемолимфы (АГ) раствор, содержащий 108 Na +, 5 мМ К +, 2 мМ Ca 2 +, 8 мм MgCl 2, 1 мМ NaH 2 4 PO, 4мм NaHCO 3, 10 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES (рН 7,1, все реагенты из Sigma Chemicals). Сахарозы и трегалозу должны быть добавлены к AH из холодильника растворы непосредственно перед использованием, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
- Принесите AH до комнатной температуры и кислородом раствор воздух-барботажных в течение 15 мин.
- Потяните несколько тонких капиллярах (например, стеклянные капилляры, 100 мкл, VWR), необходимые для удаления жира.
Личинки сердца
- Sylgard покрытием покровные: с помощью зубочистки, передачи о 50-70μl решения Sylgard на 22x22mm покровное. Пусть Sylgard затвердевают при температуре 65 ° C в течение ночи.
- Подготовка Broadie и буферных БАТЭ (135 мм NaCl, 5 мМ KCl, 4мм MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5мм ТЭС, 36мм сахароза;. РН 7,15 см. Broadie и БАТЭ, 1993).
- Подготовка инструментов, необходимых для выполнения histoacryl клея. Во-первых, вытащить несколько тонких капиллярах (например, наука Продукты GB100T8P). Подключите 1,5 мл кончика пипетки с небольшим пластикового шланга (Tygon, 1 / 32 "), вставляя меньше конец в трубку. Вставьте капилляр с его широкое отверстие на другом конце. Нагрузка капилляр с Histoacryl клея путем погружения в капиллярной капли клея и нежным всасывания в пластиковый наконечник. При работе с клеем необходимо иметь второй стеклянный капилляр под рукой, чтобы удалить чрезмерное клей от кончика клей капилляра. Клей жидкий, пока не вступает в контакт с буферным раствором, где он будет затвердевать в течение нескольких секунд. Однако, как правило, остается пластиковая достаточно долго, чтобы быть удалены из клея капиллярного кончика или при применении его в образец.
Полу-нетронутыми дрозофилы Сердце из взрослых Fly
- Взрослые мухи дрозофилы анестезировали Fly Nap (Каролина Биологические Поставка °) в течение 2-5 минут. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не оставить летит в Fly Nap для длинных выдержках. Краткосрочное воздействие холода может быть также использован для обезболивания мухи, но CO 2 не рекомендуется, поскольку она имеет более прочного влияния на частоту сердечных сокращений и ритмичность.
- Наркозом мухи помещается, сверху вниз, в чашке Петри покрыты тонким слоем вазелина. Гидрофобные кутикулы в крылья и тело обратимо "прилипать" к желе, но летать можно переместить в случае необходимости. Это становится особенно важным во время последующих манипуляций.
- Начальный разрез с использованием изогнутые ножницы весной (Roboz # 5611). Ножниц находятся под ноги и угловые вниз к дорсальной поверхности грудной клетки возле шеи. Головы, брюшной нервной цепочки, и ноги будут удалены с одного разреза. Препарат затем погружен в кислородом, искусственная гемолимфы (АГ) решение.
- Использование весной ножницы заднем конце брюшка (состоит из сегментов брюшка 7 и 8) удаляется с одного разреза. Это обеспечивает доступ для изготовления боковых разрезов по обоим краям брюшной полости и служит, чтобы разорвать связь между задней кишки и брюшной кутикулы. Освободил лоскут брюшной брюшной кутикулу удаляют.
- В шагах 3 и 4 передних и задних связи кишки порваны так органах брюшной полости в настоящее время удерживается на месте только tracheols. Кишечнике и других органах брюшной полости обычно могут быть удалены как единую массу использованием щипцов ювелирного (Roboz, # 55) и нежный дергать. Удаление внутренних органов показывает, бьющееся сердце трубки еще привязаны к спинной кутикулы окружении жира тела.
- Жира тела довольно непрозрачным в световой микроскоп, следовательно, часто бывает необходимо удалить часть этого жира, чтобы увидеть сердце трубке отчетливо. Это достигается за счет использования техники липосакции мелко обращается стеклянных капилляров. Капилляры выполнены с использованием стандартной пипетки съемник (например Саттер Р-97 Внесите Puller) и затем вставляется в пластиковую трубку (Tygon, 1 / 16 "), подключенных к вакуум источник. Эта система используется для всасывания от лишнего жира со всего сердца трубки. Всасывающая сила пропорциональна диаметр кончика пипетки так с советами более 40 микрон в диаметре не должны использоваться. Экстремальный необходимо позаботиться, чтобы не касаясь самого сердца и потому, что задняя часть сердца является очень хрупким, что региону следует избегать вообще.
- Взрослого сердца дрозофилы трубки теперь подвергаются и должны биться. При необходимости кутикулы и придает сердце может быть повторно осторожно приподнимая кутикулы из вазелина и тщательно трамбовочные его обратно, снова избегая любых контактов с сердечной ткани. В тего точки решение купания подготовки должны быть заменены свежими АХЛ. Этот препарат следует допускать, чтобы уравновесить в течение 20-30 минут с кислородом до любых манипуляций. Если препарат будет поддерживаться в течение более 60 минут, он должен будет озарен свежие АХЛ.
Иммобилизации дрозофилы личинок для оптической записи
- Место каплю клея Histoacryl близко друг к углу покровные Sylgard. Добавить 50 мкл B & B буфер для клея капли, которые застынет на месте. Заполнить пространство между клееного пятна с B & B - клей будет держать буфера на слайде.
- Возьмите блуждающих L3 личинки и положите его на кусок мокрой бумаге ткани на льду в течение 2 мин. Это замедлит его движение. Затем перенесите личинки в буфер и ориентировать его спинной стороной вверх (это сторона личинки, что не хватает зубец ремни). Быстро применить некоторые клея между областью головы и Sylgard. Клей затвердеет очень быстро и не допустить глава личинку двигаться.
- Использование щипцов тщательно схватить животное задних дыхальца и мягко растянуть. Fix личинки в этом положении, применяя клей по обеим сторонам личинки в задней половине. Чтобы уменьшить дальнейшее движение кутикулу от мышц стенки тела, добавьте больше клея на флангах животного. Личинка сейчас фиксируется в этом положении. Покровное могут быть помещены в небольшой чашке Петри заполнены АХЛ или PBS. Сердце бьется теперь можно записать без помех от движения тела стены.
Представитель Результаты:
Полу-нетронутыми взрослых дрозофил сердце будет биться ритмично в течение нескольких часов следующих рассечение, когда сохраняется в свежей, насыщенной кислородом AH (см. Справочная данных, Ocorr и соавт., 2007). Типичный пример показан в фильме 1. Сердца из 3-го возраста личинки мух и молодых (1 - 3 недели после eclosion) обычно имеют регулярное сердцебиение по ставкам в диапазоне от 1 - 3 Гц. Мухи старше 3-х недель как правило, более аритмичный, тем не менее, эти сердца все еще в состоянии разбить спонтанно в течение нескольких часов в кислородом АХЛ. Сердца у взрослых мух, которые были повреждены в результате вскрытия процедура обычно показывают локализованных областей крайнего сужения, которые не могут расслабиться. Heartbeat ставки медленнее, чем 1 Гц, редко наблюдается у мух в возрасте до 3-недельного возраста, следовательно, такие препараты, как считается, быть повреждены и отбрасываются.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 1. - одна неделя старого летать дикого типа взрослых (со штаммом 1118 лаборатории) с указанием подвергается брюшной трубки сердца (впереди слева). Обратите внимание, регулярные, ритмические сокращения. Непрозрачные регионов в верхнем правом углу находятся оставшиеся жира в брюшной полости органов; круглых клеток по обе стороны от сердца, перикарда клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель Drosophila оказался мощный генетический инструмент, который был использован для решения различных научных вопросов, начиная от эмбрионального развития к обучению и память. В последнее время этот универсальный организм модели был использован для исследования генетики функции сердца в лету. Количество попыток количественно сердце физиологии во взрослой дрозофилы полагались на наблюдениях, сделанных в интактных летит через брюшную кутикулы. Большинство из этих подходов не полагались на визуальном наблюдении или записи об изменениях в свете передатчик интенсивности через живот количественно один параметр, частоту сердечных сокращений. Эти методы имеют ряд недостатков: как правило, только передний конец сердцем можно наблюдать, что в настоящее время наблюдается это движение жира тела вторичными по отношению к сердечных сокращений и нервной вклад в сердце нетронутой. Взрослый полу-нетронутыми препарата обеспечивает более детальное представление большую часть функционирования сердца позволяет количественную оценку ряда параметров, в дополнение к сердечного ритма. Он может быть использован для электрофизиологических или оптических (см. статью Юпитера, 1435) записи процедур. Кроме того, этот препарат подходит для гистологического манипуляций (см. статью Юпитера, 1435). Она также может быть извлечена как относительно чистый образец сердечной ткани для ПЦР, Западной блоттинга микрочипов анализа и т.д.
Взрослого сердца у дрозофилы, для целей настоящего рассечение, удобно крепится к спинной кутикулу живота сеть крыловидный мышц. Таким образом, можно препарировать от головы и брюшной лежал нервов мозга, а затем удалить внутренние органы без повреждения сердца. Тем не менее, крайне осторожно следует принимать в шаге 3, чтобы сократить только самый кончик живота, как сердце простирается в брюшной сегмент 5 / 6 и клетка кардиостимулятор или клетки, несомненно, присутствует в этом регионе.
Также следует избегать прикасаться к сердцу во время вскрытия. Если контакт с сердцем подозревается подготовка должна быть отброшена. Умеренный всасывания обычно достаточно, чтобы удалить часть жира и tracheols, которые окружают сердце для лучшей визуализации сердца трубка, но чрезмерное всасывание может также повредить сердце. Сила всасывания регулируется, прежде всего, размер пипетки используются для липосакции, советами больше, чем приблизительно 40 мкм, следует избегать.
В отличие от взрослых, сердце трубки у личинки дрозофилы, относительно свободно перемещаться по полости тела. Таким образом полу-нетронутыми личиночной подготовке сердца представляет трудности для оптических методов записи. Из-за полупрозрачности покровов можно визуализировать сердце нетронутой личинки использованием светлого микроскопии. Клей методике, описанной здесь обездвиживает личинки любой стадии развития и держит сердце в фиксированном положении. Это позволяет запись относительно стационарных сердце трубки. Сердечных сокращений записаны такие иммобилизованных личинка может быть впоследствии проанализированы оптический метод записи описано в Юпитер 1435.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
КО проводится при поддержке гранта от Американской ассоциации сердца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
