Summary
Techniek die nodig is voor het visualiseren van het kloppend hart in de larven en volwassen
Abstract
De
Protocol
Voordat u begint
Volwassen harten
- Vers voor te bereiden kunstmatige hemolymfe (AH) oplossing met 108mm Na +, 5mM K +, 2 mM Ca 2 +, 8mm MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, 10mm sucrose, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7,1, alle reagentia van de Sigma Chemicals). De sucrose en trehalose moeten worden toegevoegd aan de AH uit de gekoelde voorraad oplossingen alleen maar voorafgaand aan het gebruik om bacteriële besmetting te voorkomen.
- Breng AH tot kamertemperatuur en zuurstof de oplossing door de lucht-borrelen gedurende minstens 15 minuten.
- Trek een aantal fijne haarvaten (bijv. glazen capillairen, 100ul, VWR) die nodig zijn voor het verwijderen van vet.
Larvale harten
- Sylgard-gecoate dekglaasjes: met behulp van een tandenstoker, transfer ongeveer 50-70μl van Sylgard oplossing op een 22x22mm dekglaasje aan. Laat de Sylgard uitharden bij 65 ° C gedurende de nacht.
- Bereid de Broadie en Bate's buffer (135mm NaCl, KCl 5mM, 4mm MgCl 2, 2 mM CaCl2, 5mM TES, 36mm Sucrose;. PH 7,15 Zie Broadie en Bate, 1993).
- Bereid de instrumenten die nodig zijn om de histoacryl lijm toe te passen. Trek eerst een aantal fijne haarvaten (bijv. Science Products GB100T8P). Sluit een 1,5 ml pipet tip met een kleine plastic buis (Tygon, 1 / 32 ") door het inbrengen van de kleinere uiteinde in de buis. Plaats een capillair met een brede opening naar de andere kant. Laad de capillair met Histoacryl lijm door dompelen van de capillaire in een druppel lijm en zachte zuigkracht in de plastic tip. Bij het werken met de lijm moet men een tweede glazen capillaire bij de hand om overtollige lijm te verwijderen van de punt van de lijm capillair. De lijm is vloeibaar totdat het in contact komt met de gebufferde zoutoplossing waar het zal verharden binnen een paar seconden. Het blijft echter meestal plastic lang genoeg om te worden verwijderd uit de lijm capillaire tip of om, terwijl de toepassing ervan op het monster.
Semi-intacte Drosophila Hart van de volwassen vlieg
- Volwassen Drosophila vliegen zijn verdoofd met Fly Nap (Carolina Biological Supply Co) voor 2-5 minuten. Zorg moet worden genomen niet om de vliegen te verlaten in de Fly Nap voor langere belichtingen. Korte termijn blootstelling aan koude kan ook worden gebruikt om vliegen verdoven, maar CO 2 wordt niet aanbevolen omdat het een langer aanhoudend effect op de hartfrequentie en ritmiek.
- Verdoofd vliegen zijn geplaatst, rug naar beneden, in een petrischaal gecoat met een dun laagje vaseline. De hydrofobe cuticula in de vleugels en het lichaam omkeerbaar "kleven" aan de gelei, maar de vlieg kan verplaatst worden indien nodig. Dit wordt vooral belangrijk tijdens de volgende manipulaties.
- Een eerste snede wordt gemaakt met behulp van een gebogen paar van de lente schaar (Roboz # 5611). De schaar bladen zijn geplaatst onder de benen en schuin naar beneden richting de dorsale oppervlak van de thorax de buurt van de nek. Het hoofd, ventrale zenuw koord, en de benen worden verwijderd met een enkele cut. Het preparaat wordt vervolgens ondergedompeld in een zuurstofrijk, kunstmatige hemolymfe (AH) oplossing.
- Met behulp van de lente een schaar de achterste punt van het achterlijf (bestaande uit de buik segmenten 7 en 8) wordt verwijderd met een enkele cut. Dit biedt toegang voor het maken van zijdelingse snijdt langs beide kanten van de buik en dient om verbreken de verbinding tussen de achterste darmen en de buik cuticula. De bevrijde klep van ventrale buik cuticula wordt vervolgens verwijderd.
- In stap 3 en 4 van de voorste en achterste aansluitingen van de darm worden doorgesneden, zodat de buikorganen worden nu op hun plaats gehouden alleen door tracheols. De darmen en andere buikorganen kunnen meestal worden verwijderd als een massa met behulp van juwelier pincet (Roboz, # 55) en zachte trekken. Het verwijderen van de inwendige organen onthult het kloppend hart buis nog aan de dorsale cuticula omgeven door vet lichamen.
- Het vet lichamen zijn vrij ondoorzichtig in het licht microscoop daarom is het vaak nodig om een deel van dit vet te verwijderen om het hart buis duidelijk te zien. Dit wordt bereikt door een liposuctie techniek met behulp van fijn getrokken glas haarvaten. Haarvaten zijn gemaakt met behulp van een standaard pipet trekker (bijv. Sutter P-97 pipet Puller) en worden vervolgens ingebracht in plastic buis (Tygon, 1 / 16 ") bevestigd aan een vacuüm bron. Dit systeem wordt gebruikt voor het zuigen overtollige vet van rond het hart buis. Zuigkracht is evenredig met tip diameter zo pipetten met tips die groter zijn dan 40 micron in diameter mogen niet worden gebruikt. Men moet uiterst voorzichtig worden genomen om te voorkomen dat het aanraken van het hart zelf en omdat het achterste gedeelte van het hart is zeer breekbaar dat gebied moet helemaal worden vermeden.
- De volwassen Drosophila hart buis is nu bloot en moet worden geslagen. Indien nodig de cuticula en de bijgevoegde hart kan worden verplaatst door voorzichtig het opheffen van de cuticula uit de vaseline en voorzichtig aanstampen het weer naar beneden, weer het vermijden van elk contact met het hartweefsel. Op tzijn punt de oplossing baden de voorbereiding moet worden vervangen door verse AHL. Deze voorbereiding moet worden toegestaan om equilibreren gedurende 20-30 minuten met zuurstof vóór elke manipulaties. Als het preparaat zal worden gehandhaafd voor langer dan 60 minuten moet worden geperfuseerd met verse AHL.
Immobiliseren van Drosophila larven voor optische recording
- Breng een druppel lijm Histoacryl dicht bij elke hoek van de Sylgard dekglaasjes. Voeg 50μl van B & B buffer om de lijm druppels die zal verharden direct. Vul de ruimte tussen de verlijmde vlekken met B & B - de lijm zal de buffer te houden op de dia.
- Neem een zwervende L3 larve en plaats deze op een stuk nat zijdepapier op ijs gedurende 2 minuten. Dit zal vertragen de beweging. Vervolgens overbrengen van de larve in de buffer en het oriënteren met de dorsale zijde naar boven (dit is de kant van de larve die de denticle riemen mist). Snel toe te passen wat lijm tussen het hoofd regio en de Sylgard. De lijm zal zeer snel uitharden en te voorkomen dat het hoofd van de larve van de bewegende.
- Met behulp van een tang voorzichtig grijpen het dier door de achterste siphonen en voorzichtig uitrekken. Bevestig de larve in deze positie door het aanbrengen van de lijm langs beide zijden van de larve op de achterste helft. Om verdere beweging van de cuticula te verminderen door het lichaam muur spieren, voeg meer lijm op de flanken van het dier. De larve is nu opgelost in deze positie. De dekglaasje kan worden geplaatst in een kleine petrischaal gevuld met AHL of PBS. Hart klopt kan nu worden opgenomen zonder tussenkomst van het lichaam muur bewegingen.
Representatieve resultaten:
De semi-intacte volwassen Drosophila hart zal ritmisch kloppen voor de uren na dissectie bij het onderhouden in vers, zuurstofrijk AH (zie aanvullende gegevens, Ocorr, et al., 2007).. Een representatief voorbeeld is te zien in Movie 1. Harten van 3 e instar larven en jonge vliegt (1 - 3 weken na Eclosion) in het algemeen vertonen een regelmatige hartslag bij snelheden tussen de 1 - 3 Hz. Vliegen ouder dan 3 weken over het algemeen meer aritmisch, desondanks, deze harten nog steeds in staat om spontaan verslaan urenlang in zuurstofrijk AHL. Hearts bij volwassen vliegen die zijn beschadigd als gevolg van de dissectie procedure Typisch voor gelokaliseerde gebieden van extreme vernauwing die niet in staat zijn om te ontspannen. Heartbeat tarieven langzamer dan 1 Hz worden zelden waargenomen in vliegen jonger dan 3 weken; daarom dergelijke preparaten worden beschouwd als beschadigd en worden verwijderd.
Klik hier om een film te downloaden. - Een een week oude volwassen wild-type fly (w 1118 laboratorium-stam) met de buik bloot hart buis (anterior aan de linkerkant). Let op regelmatige, ritmische samentrekkingen. Opaque regio's in de rechter bovenhoek zijn de resterende buikvet organen; ronde cellen aan weerszijden van het hart zijn pericardiale cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het Drosophila model heeft bewezen een krachtig instrument dat genetische is gebruikt om een verscheidenheid aan wetenschappelijke vragen, variërend van embryonale ontwikkeling tot leren en geheugen adres. Onlangs is dit veelzijdige model organisme is gebruikt om de genetica van de hartfunctie te onderzoeken in de vliegen. Een aantal pogingen om het hart fysiologie kwantificeren bij volwassen Drosophila hebben vertrouwd op de waarnemingen in intacte vliegt door de buik cuticula. De meeste van deze benaderingen hebben vertrouwd op visuele waarneming of opnames van de veranderingen in de lichtintensiteit zender door de buik naar een enkele parameter, de hartslag te kwantificeren. Deze methoden hebben een aantal beperkingen: meestal alleen het voorste einde van het hart kan worden waargenomen, wat wordt waargenomen is de beweging van lichamen vet secundair aan het hart weeën, en de nerveuze input voor het hart is intact. De volwassen semi-intact voorbereiding geeft een meer gedetailleerd beeld van een groot deel van de werking van hart toelaat kwantificering van een aantal parameters in aanvulling op de hartslag. Het kan worden gebruikt voor elektrofysiologische of optische (zie Jove artikel, 1435) het opnemen van procedures. Daarnaast is dit preparaat is geschikt voor histologische manipulaties (zie Jove artikel, 1435). Het kan ook worden gewonnen als een relatief schone hart weefselmonster voor PCR, Western blotting, microarray analyse, enz.
De volwassen hart in Drosophila is voor de toepassing van deze dissectie, gemakkelijk vast aan de dorsale cuticula van de buik door een netwerk van Alary spieren. Zo is het mogelijk om weg te ontleden het hoofd en het ventrale liggen zenuwen en vervolgens naar de interne organen te verwijderen zonder beschadiging van het hart. Toch moet uiterste zorg worden genomen in stap 3 om alleen het uiterste puntje van de buik gesneden als het hart zich uitstrekt tot in de buik-segment 5 / 6 en een pacemaker cel of cellen is ongetwijfeld aanwezig is in deze regio.
Er moet ook rekening worden gehouden om te voorkomen dat het aanraken van het hart tijdens de dissectie. Indien het contact met het hart wordt vermoed de bereiding dient te worden weggegooid. Matige afzuiging volstaat het meestal om te verwijderen een deel van het vet en tracheols dat het hart omringen voor een betere visualisatie van het hart buis, maar overmatige zuigkracht kan ook de schade aan het hart. De zuigkracht wordt geregeld in de eerste plaats door de grootte van de pipetpunt gebruikt voor de liposuctie, tips groter is dan ongeveer 40 micron moet worden vermeden.
In tegenstelling tot de volwassene, het hart buis in Drosophila larve is relatief vrij om te bewegen de lichaamsholte. Dus een semi-intacte larvale hart preparaat moeilijkheden voor optische opnametechnieken. Door de doorschijnendheid van de integument is het mogelijk te visualiseren het hart in de intacte larve met helderveld microscopie. De lijm techniek die hier wordt beschreven immobiliseert larve van een ontwikkelingsfase en houdt het hart in een vaste positie. Dit maakt het opnemen van een relatief stilstaande hart buis. Hart contracties geregistreerd door een dergelijke geïmmobiliseerd larve kan vervolgens worden geanalyseerd door de optische opnametechniek beschreven in Jupiter 1435.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO wordt ondersteund door een subsidie van de American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
