Summary
Tecnica necessaria per visualizzare il cuore pulsante di larve e adulti
Abstract
Il
Protocol
Prima di iniziare
Cuori adulti
- Appena preparare emolinfa artificiale (AH) soluzione contenente 108mm Na +, 5mm K +, 2mm Ca 2 +, 8 mm MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, saccarosio 10mM, trealosio 5mm, HEPES 5mm (pH 7.1, tutti i reagenti da Prodotti chimici Sigma). Il saccarosio e trealosio dovrebbero essere aggiunti alla AH dalle soluzioni magazzino refrigerato al momento dell'uso, al fine di prevenire la contaminazione batterica.
- AH portare a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione da bolle d'aria per almeno 15 min.
- Tirare diversi fini capillari (ad esempio vetro Capillari, 100ul, VWR) necessari per la rimozione di grasso.
Cuori larvale
- Sylgard rivestita coprioggetto: usando una, trasferimento stuzzicadenti circa 50-70μl di soluzione Sylgard su un vetrino 22x22mm. Lasciate che i indurire Sylgard a 65 ° C durante la notte.
- Preparare il Broadie e tampone del Bate (135mm NaCl, KCl 5mm, 4mm MgCl 2, 2mM CaCl 2, TES 5mm, Saccarosio 36mm;. PH 7,15 Vedi Broadie e Bate, 1993).
- Preparare gli strumenti necessari per applicare la colla histoacryl. In primo luogo, tirare diversi fini capillari (ad esempio Science Prodotti GB100T8P). Collegare la punta della pipetta 1,5 ml con un tubo di plastica di piccole dimensioni (Tygon, 1 / 32 "), inserendo l'estremità più piccola nella provetta. Inserire un capillare con la sua ampia apertura verso l'altra estremità. Caricare il capillare con colla Histoacryl immergendo il capillare in una goccia di colla e di aspirazione delicata nella punta di plastica. Quando si lavora con la colla si dovrebbe avere un secondo bicchiere capillare a portata di mano per rimuovere la colla eccessiva dalla punta della colla capillare. La colla è liquida fino a quando non entra in contatto con soluzione fisiologica tamponata dove si indurisce entro un paio di secondi. Tuttavia, rimane di solito in plastica abbastanza a lungo per essere rimossi dalla punta capillare colla o durante l'applicazione al modello.
Semi-intatta Cuore Drosophila dal Fly adulti
- Adulto vola Drosophila sono anestetizzati con Nap Fly (Carolina Biological Supply Co.) per 2-5 minuti. Bisogna fare attenzione a non lasciare le mosche nel Nap Fly per esposizioni più lunghe. Esposizione a breve termine al freddo può anche essere utilizzato per anestetizzare le mosche, ma di CO 2 non è raccomandato in quanto ha più effetti duraturi sulla frequenza cardiaca e ritmicità.
- Vola anestetizzati sono posti, lato dorsale verso il basso, in una piastra di Petri rivestiti con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobo nelle ali e il corpo reversibile "bastone" per la gelatina, ma il volo può essere riposizionato, se necessario. Questo diventa particolarmente importante durante le manipolazioni successive.
- Un primo taglio è realizzato con un paio di forbici curve primavera (Roboz # 5611). Le lame a forbice sono posti sotto le gambe e angolati verso il basso verso la superficie dorsale del torace, vicino al collo. La testa, cordone nervoso ventrale, e le gambe vengono rimossi con un unico taglio. La preparazione viene poi immerso in un ossigenato, emolinfa artificiale (AH) soluzione.
- Utilizzando le forbici molla la punta posteriore dell'addome (formato da segmenti addominali 7 e 8) viene rimosso con un unico taglio. Questo consente l'accesso di questi tagli, lungo entrambi i bordi laterali dell'addome e serve a recidere il legame tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale. Il lembo libero della cuticola ventrale addominale viene quindi rimosso.
- Nei passaggi 3 e 4 le connessioni anteriore e posteriore dell'intestino sono così reciso gli organi addominali sono ora tenuti in posizione da solo tracheols. L'intestino e altri organi addominali di solito può essere rimosso come una massa unica con pinze gioielleria (Roboz, # 55) e gentile strattoni. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cuore pulsante ancora attaccato alla cuticola dorsale circondato da corpi grassi.
- I corpi grassi sono abbastanza opachi al microscopio ottico, di conseguenza è spesso necessario per rimuovere una parte di questo grasso per vedere il tubo di cuore in modo chiaro. Questo si ottiene utilizzando una tecnica di liposuzione finemente disegnate vetro capillari. Capillari sono realizzati con uno standard pipetta estrattore (Es. Sutter P-97 pipette Puller) e vengono poi inseriti in tubi in plastica (Tygon, 1 / 16 ") collegato a una fonte di vuoto. Questo sistema è utilizzato per aspirazione il grasso in eccesso attorno al tubo cuore. Forza di aspirazione è proporzionale al diametro della punta in modo pipette con le punte maggiori di 40 micron di diametro non deve essere utilizzato. Estrema cura deve essere presa per evitare di toccare il cuore stesso e perché la parte posteriore del cuore è molto fragile, che la regione dovrebbe essere evitato del tutto.
- L'adulto tubo cuore Drosophila è ora esposta e va a battere. Se necessario, il cuore della cuticola e allegata possono essere riposizionati da sollevando delicatamente la cuticola fuori la vaselina e con attenzione pigiatura indietro, sempre evitando ogni contatto con il tessuto cardiaco. Til suo punto la soluzione balneari la preparazione deve essere sostituita con AHL fresca. Questa preparazione deve essere lasciato equilibrare per 20-30 minuti con l'ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione. Se la preparazione deve essere mantenuta per più di 60 minuti dovrebbe essere perfusi con AHL fresca.
Immobilizzare le larve di Drosophila per la registrazione ottica
- Mettere una goccia di colla Histoacryl vicino a ogni angolo del coprioggetto Sylgard. Aggiungere 50μl di B & B buffer per le gocce di colla che si indurisce immediatamente. Riempire lo spazio tra i punti incollati con B & B - la colla non mancherà di tenere il tampone sul vetrino.
- Prendete una larva L3 errante e mettetelo su un foglio di carta velina bagnata in ghiaccio per 2 minuti. Questo rallenterà il suo movimento. Poi trasferire la larva nel buffer e orientarlo con la parte dorsale verso l'alto (questo è il lato della larva che non ha le cinture dentino). Applicare rapidamente po 'di colla tra la regione della testa e del Sylgard. La colla si indurisce molto rapidamente e prevenire il capo della larva di muoversi.
- Utilizzando pinze attentamente afferrare l'animale dal spiracoli posteriori e delicatamente stretch. Fissare la larva in questa posizione applicando la colla lungo entrambi i lati della larva a metà posteriore. Per ridurre ulteriormente il movimento della cuticola dalla muscoli della parete del corpo, aggiungere la colla per i fianchi dell'animale. La larva è ora fissato in questa posizione. Il coprioggetto può essere collocato in una piccola scatola di Petri piena di AHL o PBS. Battiti cardiaci possono essere registrati senza interferenze da parte dei movimenti parete del corpo.
Rappresentante dei risultati:
Il semi-intatti cuore adulto Drosophila batterà ritmicamente per ore seguenti dissezione quando mantenuto in fresco, AH ossigenata (vedi Dati supplementari, Ocorr, et al., 2007). Un esempio rappresentativo è mostrato in Movie 1. Cuori da 3 larva ° instar e vola giovani (1 - 3 settimane dopo eclosion) in genere mostrano un ritmo regolare cuore a tassi tra l'1 - 3 Hz. Vola più di 3 settimane in genere sono più aritmici, tuttavia, questi cuori sono ancora in grado di battere spontaneamente per ore in AHL ossigenato. Cuori in mosche adulte che sono danneggiati come conseguenza della procedura di dissezione mostrano tipicamente le regioni localizzate di costrizione estrema, che non sono in grado di rilassarsi. Tassi di battito cardiaco più lento di 1 Hz sono raramente osservati nelle mosche meno di 3 settimane di età, di conseguenza tali preparati sono considerati danneggiati e vengono scartati.
Clicca qui per scaricare film 1. - Una settimana quella vecchia volare tipo selvatico adulto (ceppo di laboratorio w 1118) che mostra il tubo esposto cuore addominale (anteriore a sinistra). Nota regolare, contrazioni ritmiche. Regioni opache nell'angolo in alto a destra ci sono i restanti corpi grasso addominale; cellule rotonde su entrambi i lati del cuore sono cellule del pericardio.
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Discussion
Il modello Drosophila ha dimostrato di essere un potente strumento genetico che è stato usato per affrontare una serie di quesiti scientifici che spaziano dallo sviluppo embrionale all'apprendimento e alla memoria. Di recente questo organismo modello versatile è stato utilizzato per studiare la genetica della funzione cardiaca in tempo reale. Un certo numero di tentativi di quantificare fisiologia cardiaca in adulti Drosophila si sono basati sulle osservazioni fatte nei moscerini intatta attraverso la cuticola addominale. La maggior parte di questi approcci sono basati sull'osservazione visiva o registrazioni delle variazioni del trasmettitore intensità della luce attraverso l'addome a quantificare un unico parametro, la frequenza cardiaca. Questi metodi hanno diverse limitazioni: in genere solo l'estremità anteriore del cuore può essere osservato, ciò che viene osservato è il movimento dei corpi grassi secondaria alle contrazioni cardiache, e l'ingresso nervoso per il cuore è intatto. L'adulto semi-intatta preparazione fornisce una visualizzazione più dettagliata di una grande porzione della quantificazione cuore funzionamento permettendo di una serie di parametri oltre alla frequenza cardiaca. Può essere utilizzato per elettrofisiologico o ottico (vedi articolo Giove, 1435) le procedure di registrazione. Inoltre, questa preparazione è adatto per manipolazioni istologiche (vedi articolo Giove, 1435). Può anche essere estratto come un campione di tessuto cardiaco relativamente pulito per PCR, Western blotting, analisi microarray, ecc
Il cuore adulto in Drosophila è, ai fini di questa dissezione, comodamente fissato alla cuticola dorsale dell'addome da una rete di muscoli Alary. Così è possibile sezionare via la testa e il cordone nervoso ventrale mentire, e poi per rimuovere gli organi interni senza danneggiare il cuore. Tuttavia, la cura estrema dovrebbe essere presa al punto 3 di tagliare solo la punta dell'addome come il cuore del segmento addominale si estende in 5 / 6 e una cellula o di cellule pacemaker è indubbiamente presente in questa regione.
Bisogna anche fare attenzione a non toccare il cuore durante la dissezione. Se il contatto con il cuore si sospetta la preparazione deve essere scartato. Aspirazione moderata di solito è sufficiente per rimuovere alcuni dei grassi e tracheols che circondano il cuore per una migliore visualizzazione del tubo di cuore, ma di aspirazione eccessiva può anche danneggiare il cuore. La forza di aspirazione è controllato principalmente dalle dimensioni della punta della pipetta utilizzata per la liposuzione; punte più grandi di circa 40 micron dovrebbe essere evitato.
A differenza degli adulti, il tubo cuore in larva Drosophila è relativamente libero di muoversi intorno alla cavità del corpo. Così un semi-intatta preparazione cuore larvale presenta difficoltà tecniche per la registrazione ottica. A causa della trasparenza del tegumento è possibile visualizzare il cuore in larva intatti usando la microscopia campo chiaro. La tecnica qui descritta colla immobilizza larva di qualsiasi stadio di sviluppo e mantiene il cuore in una posizione fissa. Questo permette la registrazione di un tubo di cuore relativamente stazionaria. Contrazioni del cuore registrato da tale larva immobilizzato possono essere successivamente analizzati con la tecnica di registrazione ottica descritta in JOVE 1435.
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Acknowledgments
KO è sostenuto da un finanziamento della American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
