Summary
此协议表明如何保持健康，未分化的人类胚胎干细胞（ES）。
Abstract
人类胚胎干细胞（HES），必须监测和照顾，为了保持健康，未分化的文化。最低限度，必须美联储文化，每天执行一个完整的介质的变化，以补充丢失的营养物质和保持文化不必要的分化因子。虽然少量的分化是正常的，预计在干细胞培养，文化应定期清理手动删除，或“捡”有区别的地区。查明和消除多余的胚胎干细胞培养分化，是在维护一个健康的细胞人口的基本技术。
Protocol
1。维护：在显微镜下观察文化
- 从37℃培养箱中取出胚胎干细胞的板和带来的显微镜。
- 注意在低功率的殖民地，使用2倍或5倍的放大倍率，以评估整体文化素质。请注意以下几点：中等颜色正常，没有任何可见的污染，整个聚落的大小，质量和密度，以及任何其他意见。
- 观察中的颜色变化。由于在pH值的变化和孵育过夜后，与胚胎干细胞的培养基中的营养物质耗尽，介质会改变一个红色的“救命稻草”的色彩。如果中期出现紫色的，一个基本的pH值变化已经发生。如果介质出现极其黄色，中型酸化。很黄介质可能会非常拥挤的殖民地井或污染的结果。媒介应该出现在任何时候都清楚的。虽然在中期的细胞碎片一定程度是正常的，它不应该出现浑浊。如果观察到一个高水平的细胞碎片，文化健康及可能被污染。
- 如果文化不要求维修或传代，他们可以采取的生物安全柜，美联储（见第2节）。
- 如果文化中含有约10％，区分菌落多，细胞应该是“清理”手动删除有区别的地区（见第3节）。
- 如果文化包含大或密集的殖民地，或MEF饲养层超过12天，应传代细胞（见第4节）。
2。进料胚胎干细胞
- 在无菌的生物安全柜，取出培养皿的盖子，并吸出花了中等。不要让吸管尖碰板直接内水井以外的任何部分。如果有任何的污染问题，改变到一个新的，无菌的吸管。
- 使用无菌玻璃吸管，回暖的胚胎干细胞培养液中添加适量的每口井。对于在6孔板文化，每孔加入2.5毫升培养基。
- 返回板的孵化器，以保持在37 ° C和5％的CO 2 。
3。删除从胚胎干细胞培养分化
- 采摘工具转换成9英寸的玻璃巴斯德吸管成型控制在酒精灯火焰的提示。可以肯定的吸管尖密封，以防止污染和圆角，避免划伤塑料培养皿。消毒前使用生物安全柜在使用紫外线光源，或采摘外壳采摘工具。
- 删除有区别的地区。分化往往发生在一个胚胎干细胞集落，通常沿着边缘或中心隔离点，只有一部分。如果只有一个殖民地的部分是区分的，只有差异化方面的需求被删除。分化往往可以解除“粘”表板，它是有帮助的首次单独从殖民地的其余部分分化的细胞，由殖民地通过绘制一条线，采摘工具。
- 一旦殖民地的部分分离出来，轻轻地沿板滑行采摘工具，以分离不需要的细胞。小心不刮走太多的MEF饲养层之间在这一进程中的殖民地。
- 当分化的细胞都是从板（和浮在中期）删除，回归文化的生物安全柜。吸分化细胞的培养基中含有与新鲜胚胎干细胞培养液更换。
4。传代胚胎干细胞
酶孵化
- 在无菌的生物安全柜，取出的6孔培养皿的盖子，并从代井吸花的介质。不要让吸管尖碰板直接内水井以外的任何部分。
- 使用无菌玻璃吸管，添加1毫升回暖胶原酶以及每个要传。
- 5分钟，37℃孵化器返回板块。
刮池的胚胎干细胞
- 在培育的细胞胶原酶，在显微镜下观察的殖民地。这种酶，应引起一个微妙而明显的变化，在殖民地边缘。
- 在生物安全柜，轻轻吸出每口井的酶和取代2.0毫升胚胎干细胞培养液中。
- 提示稍对你的培养板，并用5毫升的玻璃吸管取2.0毫升培养基中的第一口井。拿着吸管垂直板底部，轻轻地滑过整个以及吸管尖，一边慢慢释放介质。
- 重复的拼抢和pipetti议员的议案3-4次，直到所有的殖民地已被调离井。吸取轻轻避免太小件分解成殖民地。当细胞从第一口井已被删除，留下的内容，并在井开始刮的未来以及细胞。
- 当所有要传的井已被刮掉，池的培养基中含有从每口井在无菌的15 mL锥形管的殖民地件。
- 胚胎干细胞培养液中加入1毫升每口井的冲洗刮井。收藏本冲洗，并转移到锥形管。
- 吸取的细胞轻轻地在管分手殖民地件所需的大小。
- 5分钟后，细胞离心200 × G.
电镀胚胎干细胞的细胞
- 虽然胚胎干细胞在离心机，准备一个新的6 MEF馈线板。标签：细胞系与适当的胚胎干细胞的信息板，新的通道数量，并通过日期。从水井吸的MEF介质，每孔加入1.0毫升的PBS。轻轻旋流井周围的缓冲区和吸出PBS冲洗。加入1.5 mL的胚胎干细胞培养液中，每孔和预留设置的板块。
- 当胚胎干细胞完成离心，使管的生物安全柜。吸出上清液，小心不要去打扰松散包装的细胞沉淀。
- 颗粒细胞重悬于1毫升胚胎干细胞培养液中，每孔镀足够的介质。当分裂成6口新井，6毫升培养基中的颗粒悬浮。
- 1毫升细胞悬液，轻轻地，均匀地添加到每个准备MEF馈线板。
- 放置到37℃孵化器板，小心地将板着回来，方方，均匀地分布在整个以及细胞。
- 允许细胞附加在37 ° C过夜。
5。代表性的成果：
未分化的胚胎干细胞是小的，紧密包装，通常包括更大，更出细胞扩散。在殖民地（图1A）或殖民地（图3B）之间的分化可能会发生。
在低倍率显微镜下下可以看到不同的morhopologies。在图2a可见，一个良好的细胞形态，包含小，单层生长的细胞排列紧密。细胞应该具有清洁，定义的边缘，几乎没有差异。在图2b所示的细胞传代，都是人满为患，在图2C所示的细胞。
图1。分化的胚胎干文化 （一）（二）分化殖民地之间的殖民地的分化。
图2。在hES文化形貌看到 。 （一）（二）良好的细胞形态的胚胎干细胞，传代（三）拥挤的牢房准备。
Discussion
与胚胎干细胞时，在任何时候都必须保持无菌。清洗和消毒的生物安全柜在使用前，所有设备。所有的试剂，使用0.22微米孔径过滤器在使用前必须经过过滤。 antiboiotics在使用胚胎干细胞培养，是没有必要的，应该避免。
应该成立一个单独的环境作为一个指定的配货站。站无菌外壳可以是一个静态的外壳用的紫外线光源，层流罩，或生物安全柜（如PCR技术工作站）。需要一个分拣站内的解剖显微镜观察菌落有区别的地区都将被删除。一个静态的外壳或生物安全柜前玻璃面板，必须进行修改，以允许在显微镜的目镜，通过面板扩展，而不影响正常的气流和无菌。
要保持健康的胚胎干细胞培养，细胞传代的最佳时机，通常每4-7天。这时的殖民地已经达到其最大大小，并可能开始合并。合并后的殖民地可以增加在文化的分化率。分流比一般介于1:3和1:5的殖民地镀，扩张速度，和文化条件而定。 Overplated殖民地（分割比率太低）可能会过早地合并和需要代才达到其最大大小。
MEF饲养层，是2周以上的历史文化，必须将支持未分化生长和增殖的新MEFs传。
由于胚胎干细胞培养分化自然发生的，少量的预期。频繁或过度分化可能发生的文化，如果没有得到适当的照顾。细胞必须每天喂，段落之间的过度生长，应避免。请务必使用新的试剂。所有的媒体，MEFs和试剂应使用14天之内，以避免未分化的胚胎干细胞的生长。大量的试剂，如基因敲除血清替代，FBS和MEFs，使用前应进行筛选。请记住，以传代之前不会删除任何分化的细胞将被转移到新的文化。另外，尽量保持在37 ° C尽可能的细胞。最小的细胞花费的孵化器外（例如，在显微镜阶段或在生物安全柜。）加热显微镜阶段可以是非常有益的，如果细胞的孵化器长时间。
在显微镜下观察胚胎干细胞培养时，先评估的整体素质和规模的殖民地视图中使用了低功耗（2倍或5倍）的目标。如果可能分化的细胞在低功耗观察，确认使用高倍物镜（10X）的分化形态。
后立即删除分化，殖民地的边缘可能会出现锯齿状或损坏。在新鲜培养基孵育过夜的殖民地，让剩余的未分化的细胞恢复。如果没有在文化差异的影响，这些剩余的殖民地将继续增殖正常。
如果可能的话，开始使用低通过胚胎干细胞的实验。主要实验之前和之后的所有染色体核型的细胞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
