Summary
Мы представляем новый и мощный интеграции нанофотоники (QD-FRET) и микрофлюидики исследовать образование полиэлектролитных polyplexes, который, как ожидается, обеспечит лучший контроль и синтеза однородным и настраиваемый polyplexes для будущего на основе нуклеиновой кислоты терапии.
Abstract
Достижения в области геномики, по-прежнему способствуют развитию терапии, которые могут ориентироваться на патогенез на клеточном и молекулярном уровне. Обычно функциональные внутри клетки, на основе нуклеиновой кислоты терапии требуют эффективной системы внутриклеточной доставки. Одним из широко принятый подход заключается в комплексе с ДНК гена перевозчика форме нанокомплексов через электростатическое самостоятельной сборки, облегчение клеточное поглощение ДНК, защищая ее от деградации. Проблема заключается в рациональной разработки эффективных носителей гена, так как преждевременное диссоциации или слишком стабильной обязательным будет иметь пагубные последствия для клеточного поглощения и терапевтической эффективности. Нанокомплексов синтезированных объемной смешивания показали разнообразные внутриклеточные распаковки и торговли поведение, которое было связано с неоднородностью по размеру и стабильность нанокластеров. Такие неоднородности затрудняет точную оценку самосборки кинетики и добавляет трудностей при сопоставлении их физических свойств трансфекции эффективности или биологическую активность. Мы представляем новый конвергенции нанофотоники (например, КТ-FRET) и микрофлюидики для характеристики в режиме реального времени кинетики nanocomplex самосборки под ламинарным потоком. QD-FRET обеспечивает очень чувствительным индикатором наступления молекулярных взаимодействий и количественную меру во всем процессе синтеза, в то время микрофлюидики предлагает хорошо контролируемых микроокружения на пространственный анализ процессов с высоким временным разрешением (~ миллисекунд). Для модельной системы полимерных нанокомплексов, два различных этапах процесса самосборки были захвачены этой аналитической платформы. Кинетическую сторону процесса самосборки, полученных при микромасштабной будет особенно ценным для микрореактора основе реакций, которые имеют отношение к многим микро-и нано-приложений. Кроме того, нанокомплексов могут быть настроены посредством правильного дизайна microfludic устройств, а также в результате КТ-FRET полимерных нанокомплексов ДНК можно легко применить для установления структурно-функциональных отношений.
Protocol
А. биотинилирование ДНК
Плазмиды ДНК ковалентно биотинилированного с гуанин-биотин конкретные ярлыки, как описывается производителем (Mirus Bio, Мэдисон, Висконсин), но в масштабе у ~ 1-2 биотин этикеток в ДНК. ДНК плазмиды (pEGFP-C1, 4,9 кб, Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния) был назван в этом протоколе.
- Растворите необходимое количество плазмидной ДНК в ТЕ буфере без ДНКазы и РНКазы, свободного (молекулярная биология класса качества) воды, чтобы сделать 1μg/μL решение ДНК.
- Поведение маркировки реакции с помощью следующей смеси реакции. Добавить этикетке реагента в последнюю очередь.
Для 100μg реакции ДНК:
| ДНКазы без РНКазы и без воды | 75 мкл |
| 10X Буфер маркировки | 20 мкл |
| 1μg/μL ДНК | 100 мкл |
| Этикетка ИТ-реагент | 5 мкл |
| Общий объем | 200 мкл |
- Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 1 часа.
- Purify помечены образца этанол или изопропанол осадков следующие стандартные протоколы.
Примечание: Гель-фильтрация основана столбцов может привести к большой поглощения ультрафиолетового или флуоресценции фон, который может повлиять на ДНК или количественную характеристику флуоресценции.
Примечание: уровень биотинилирование которые могут быть определены HABA-тесты.
Б. Маркировка Cy5-катионного полимера
Хитозан (390 кДа, 83,5% деацетилированного, Vanson, Редмонд, штат Вашингтон) использовали в качестве модели катионного полимера в данном исследовании. Бесплатное начальное аминов на позвоночник хитозан полимером были помечены Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
- Чтобы облегчить полное сопряжение Cy5 красителя, рассчитать необходимое количество Cy5-NHS, что молярное соотношение Cy5: первичные амины составляет 1: 200.
- Отрегулируйте рН раствора хитозана (в 25 мМ ацетатного буфера) до ~ 6,5 добавлением NaOH. Обратите внимание, что реакция NHS является более эффективным в основных рН, но растворимость хитозана здесь пределы рабочего диапазона рН.
- При перемешивании, постепенно добавить расчетное количество Cy5-NHS (1 мг / мл ДМСО) к решению хитозана в капельный образом.
- Перемешивают смесь в темноте при комнатной температуре в течение ночи.
- Для очистки, диализировать с 10k MWCO Слайд-а-Lyzer (Pierce) в течение 2 часов против 1% ацетатный буфер при комнатной температуре в темноте.
- Замените буфера и диализировать еще 2 часа при комнатной температуре в темноте.
- Замените буфера и диализировать течение ночи при 4 ° С в темноте.
- Магазин очищенного меченого полимера при температуре -20 ° C.
Примечание: В этом исследовании, стандартная кривая строится путем измерения интенсивности излучения Cy5-NHS эфира при 670 нм. Охарактеризовать маркировки плотности путем измерения получены излучения при 670 нм от Cy5 меченных хитозана в стандартной кривой. Поглощение может также быть использована для определения маркировки эффективность, но не проводился здесь.
С. Подготовка QD-меченых ДНК и Cy5-полимерный
Молярное отношение плазмидной к КТ находился в избытке (плазмидной: QD ≈ 1: 2), чтобы обеспечить полное сопряжение КТ в плазмидной ДНК. Число КТ помечены на каждой плазмидной можно оценить через ПЭМ изображений или других аналогичных объектов. В нашем исследовании, число КТ в плазмидной оценивается в ~ 1-3 по ТЕА и одного спектроскопии молекул. 1 Используйте Millipore Milli-Q Градиент воды (> 18,0 МВт, 0.2um фильтруется) во время подготовки.
- Рассчитать необходимое количество хитозана для 10 мкг плазмидной ДНК в соответствии с желаемой N / P соотношение, теоретическое отношение протонированных аминов в раствор хитозана отрицательный фосфатов в раствор ДНК.
- Добавить стрептавидин-функционализированных 605QDs (Qdot 605 ИТК, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в биотинилированного решение плазмидной.
- Выдержите растворе при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.
- Добавить QD-меченых ДНК в 50 мМ раствора сульфата натрия, чтобы сделать окончательный объем 200 мкл.
- Развести Cy5-хитозан, в соответствии с желаемой N / P соотношение с Milli-Q воды, чтобы сделать окончательный объем 200 мкл.
Примечание: следует реакция в темном, чтобы предотвратить возможные фотообесцвечивания.
Важно: Будьте осторожны, чтобы использовать Qdot 605 ИТК ™ стрептавидин сопряжены (ИТК серии), как квантовые точки в этом каталоге, предназначены для целей FRET. Очередная серия Qdot сопряжены со слоем PEG для предотвращения неспецифического связывания, особенно для сотовых маркировки. Тем не менее, это дополнительное покрытие увеличивает донорно-акцепторных расстояние, что приводит к тразвитую эффективность передачи энергии.
Д. Изготовление SU-8 Мастеров Использование стандартных Фотолитография
- Si пластины пираньи очищены и запекать при 200 ° С в течение 5 мин.
- Для назначенный мастером толщиной 25 мкм, спина пальто отрицательные фоторезиста (ГУ-8 2025 года, Microchem, Ньютон, штат Массачусетс) на Si пластин на 2000 оборотов в минуту в течение 30 сек.
- Мягкие выпекать пластины на плиту с рампы 65 ° С / ч до 95 ° C.
- Подвергать воздействию УФ-светом (365 нм) для 250mJ/cm 2 по маске фильм (CAD / Искусство услуги, Бэндон, ИЛИ), содержащие дизайн микроканалов.
- Постконтактная выпекать пластины на плиту с рампы 65 ° С / ч до 95 ° C.
- Разработка пластин использовании SU-8 фоторезиста разработчика.
- Узорные пластины жесткого запеченные на плиту с рампы 65 ° С / ч до 200 ° C. Поддерживать пластины при температуре 200 ° С в течение не менее 5 часов, затем постепенно охладить пластины до комнатной температуры.
Важно: Постепенное наращивает во время СУ-8 мастера выпечки процесс необходим, в противном случае SU-8 структура может отделяться от кремниевой пластины или трещины на СУ-8 структура может быть вызвано стрессом релизе.
Е. Реплика Формование PDMS от мастеров и соединение с защитным стеклом
- SU-8 мастера помещают в лодку весом.
- Смешайте силиконового эластомера и отвердителя (Поли (диметилсилоксана), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) в 10: 1 отношение.
- Вылейте смесь PDMS на СУ-8 мастер и оставить вес лодки в вакуум-эксикаторе, чтобы удалить пузырьки.
- Cure PDMS при 65 ° С в течение 1-2 часов.
- Пил полосы PDMS из формы мастера Si.
- Удар канала входы и выходы из жидкостных устройств.
- Чистая PDMS полосы и покровного стекла с этанолом, а затем воздушно-сухой.
- Лечить очищены PDMS полосы и покровного стекла с кислородной плазмы (20 Вт в течение 1 мин).
- Сразу же связь полосы PDMS с крышкой стекла.
- Оставьте связанных микрожидкостных чипов в духовке при температуре 95 ° С в течение ночи.
Важно: Плазменная обработка и размещение выпечки имеют важное значение для повышенной прочности склеивания.
Ф. монитор образования ДНК нанокомплексов В микрожидкостных устройств
- Заполните микрожидкостных канал с водой (чтобы у пассажиров было никаких пузырей в микрожидкостных канал), перед загрузкой реагентами для обеспечения беспрепятственного потока во время эксперимента.
- Нагрузка QD-меченых ДНК и Cy5 меченных растворах хитозана на две отдельные шприцы стекло, через трубку описано в видео.
- Подключение трубки с двумя отверстиями микрожидкостных устройств. Будьте осторожны, чтобы не вводить каких-либо воздуха во время процесса. Установить расход, при 20nL/min (PHD-2000 шприцевой насос, Холлистон, Массачусетс), в условиях ламинарного потока.
- Проверьте микроканалов под микроскопом.
- Когда течение устойчиво (~ 15 до 20 минут), КТ-опосредованной FRET должен наблюдаться в центре канала.
- Возьмите флуоресценции изображений (охлаждением ПЗС, Qimaging, Британская Колумбия, Канада) в разных местах вдоль канала.
- Анализ флуоресцентных изображений с ImageJ и OriginLab.
Рисунок 1. QD-FRET является чувствительным показателем начала ДНК нанокомплексов самосборки
- Квантовая точка-опосредованной флуоресценции передачи энергии резонанса (QD-FRET) может обеспечить количественное и высокочувствительным показателем стабильности в Polyplex либо экстра-или внутриклеточной среды, что позволяет однозначного обнаружения начала взаимодействия между ДНК и генов перевозчика. FRET пары, 605QD и Cy5, была выбрана на основе максимального спектрального перекрытия между донором и акцептором и минимизации потенциальных перекрестных помех. Для этой пары, расстояние Форстер 69.4Å 3.
- Самосборка QD-FRET нанокомплексов ДНК. Анионные плазмидной ДНК (плазмидной) и катионного носителя гена были помечены КТ (энергия донора) и Cy5 (акцептором энергии), соответственно. QD-FRET нанокомплексов были сформированы через электростатическое комплекс коацервации. При возбуждении на 488 нм, QD-FRET-опосредованной Cy5 выбросов указанных образованию компактной и нетронутыми nanocomplex. Время пребывания (т R) может быть рассчитана в зависимости от расстояния (х), который измеряет от того, где два потока встречаются, чтобы положение реакции под следствием, и средняя скорость потока (объем). Из-за характера ламинарного течения, перемешивания происходит только на границе (в центре каждого изображения), что позволяет точный расчет массопереноса в зависимости от т R. Временное разрешение можно регулировать путем изменения applieставки г потока. (Вставка) FRET-опосредованный сигнал наблюдался непосредственно на границе, когда два потока встретились, указывая, что обязательным было быстрым, происходящих в течение нескольких миллисекунд в зависимости от применяемых скоростях потока. Шкала бар: 100 мкм.
Discussion
- Значение нашей работы:
- Это первая попытка контролировать полимерной ДНК nanocomplex самосборки кинетики в режиме реального времени (миллисекунды разрешения) через QD-FRET ответы в течение простые микрожидкостных чипов.
- КТ-опосредованной FRET обеспечивает высокую чувствительность и количественных показателей наступления молекулярных взаимодействий и в течение всего процесса самосборки, в то время микрофлюидики предлагает хорошо контролируемых микроокружения пространственно анализировать процесс, в ходе синтеза nanocomplex ДНК.
- Интеграция микрофлюидики и нанофотоники предлагает новый и интересный подход к расследованию любого типа комплексообразования.
- В результате КТ-FRET полимерных нанокомплексов ДНК можно легко применить для установления структурно-функциональных отношений. 1,2
Acknowledgments
Финансирование поддержки со стороны NIH грант HL89764, NSF гранты 0546012, 0730503 и 0725528.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H.
