Summary
Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.
Abstract
Avanços na genômica continuar a alimentar o desenvolvimento de terapêuticas que possam alvo patogenia a nível celular e molecular. Tipicamente funcional dentro da célula, baseados em ácido nucléico terapêuticas requerem um sistema de entrega eficiente intracelular. Uma abordagem amplamente adotado é o de DNA complexo com um portador do gene para formar nanocomplexes via eletrostática auto-montagem, facilitando a captação celular de DNA, protegendo-o contra a degradação. O desafio consiste no desenho racional de portadores do gene eficiente, uma vez que a dissociação prematura ou excessivamente ligação estável seria prejudicial para a absorção celular e eficácia terapêutica. Nanocomplexes sintetizados através da mistura de massa mostrou uma grande diversidade de comportamento intracelular desembalar e tráfico, o que foi atribuído à heterogeneidade no tamanho e na estabilidade do nanocomplexes. Essa heterogeneidade dificulta a avaliação exata da cinética de auto-montagem e contribui para a dificuldade em correlacionar suas propriedades físico para a eficiência de transfecção ou bioativos. Nós apresentamos uma convergência romance de nanofotônica (ie QD-FRET) e microfluídica para caracterizar a cinética em tempo real do nanocomplex auto-montagem sob fluxo laminar. QD-FRET fornece uma indicação altamente sensível do início de interações moleculares e medida quantitativa em todo o processo de síntese, enquanto a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo com alta resolução temporal (~ milissegundos). Para o sistema modelo de nanocomplexes poliméricos, duas etapas distintas no processo de auto-montagem foram capturados por esta plataforma analítica. O aspecto cinética do processo de auto-montagem obtidos em microescala seria particularmente valiosos para microreactor baseado reações que são relevantes para muitas aplicações de micro e nano-escala. Além disso, nanocomplexes pode ser personalizada através de um design adequado dos dispositivos microfludic, ea conseqüente QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função.
Protocol
A. Biotinilação de DNA
DNA plasmidial foram covalentemente biotinilado guanina com etiquetas específicas biotina, conforme descrito pelo fabricante (Mirus Bio, Madison, WI), mas dimensionada para ter ~ 1-2 rótulos biotina por DNA. DNA plasmídeo (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) foi rotulada neste protocolo.
- Dissolver quantidade desejada de PDNA em tampão TE de DNase e livre de RNase-free (qualidade de biologia molecular-grade) de água para fazer uma solução de DNA 1μg/μL.
- Realizar a reação rotulagem usando as misturas de reacção seguinte. Adicione o rótulo de TI último reagente.
DNA para a reação 100μg:
| DNase-RNase livre e sem água | 75 mL |
| Tampão 10X Labeling A | 20 mL |
| 1μg/μL DNA | 100 L |
| Rotulá-la de reagente | 5 mL |
| Volume Total | 200 mL |
- Incubar a reação a 37 ° C por 1 hora.
- Purificar a amostra rotulada por etanol ou isopropanol precipitação seguintes protocolos padrão.
Nota: as colunas de filtração em gel com base pode levar a absorbância UV alto ou o fundo de fluorescência, que pode afetar a quantificação de DNA ou a caracterização de fluorescência.
Nota: O nível de Biotinilação pode ser determinada por Haba baseado em testes.
B. Rotulagem da Polymer Cy5-Catiônicos
Quitosana (390 kDa, 83,5% desacetilado, Vanson, Redmond, WA) foi usado como um polímero catiônico modelo neste estudo. As aminas primária gratuita na espinha dorsal do polímero quitosana foram marcados com Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
- Para facilitar a conjugação completa dos Cy5 corante, calcular a quantidade necessária de Cy5-NHS tal que a relação molar de Cy5: aminas primárias é de 1: 200.
- Ajustar o pH da solução de quitosana (em tampão acetato 25mM) para ~ 6,5 pela adição de NaOH. Note-se que a reação do SNS é mais eficiente em pH básico, mas a solubilidade da quitosana aqui limita a faixa de pH de trabalho.
- Agitando, lentamente adicione o montante calculado de Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) para a solução de quitosana de forma gota a gota.
- Agitar a mistura no escuro à temperatura ambiente durante a noite.
- Para purificar, diálise com 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) por 2 horas contra tampão acetato de 1% à temperatura ambiente no escuro.
- Substituir buffer e diálise outra hr 2 à temperatura ambiente no escuro.
- Substituir buffer e diálise overnight a 4 ° C no escuro.
- Loja purificada rotulados de polímero a -20 ° C.
Nota: Neste estudo, uma curva padrão é construída através da medição da intensidade de emissão de Cy5 NHS-éster a 670 nm. Caracterizar a densidade de rotulagem, pela medição da emissão obtidos a 670 nm de Cy5 marcado com quitosana na curva padrão. Absorbância também pode ser usado para determinar a eficiência de marcação, mas não foi realizado aqui.
C. Preparação do QD-rotulados de DNA e Cy5-Polymer
A razão molar de PDNA para QD foi mantido em excesso (PDNA: QD ≈ 1, 2) para garantir a conjugação completa dos QDs para PDNA. O número de QDs rotulados em cada PDNA pode ser estimado através TEM imagens ou outros recursos equivalentes. Em nosso estudo, o número de QDs por PDNA é estimado em ~ 1-3 por TEM e espectroscopia única molécula. Use um Millipore Milli-Q de água gradiente (> 18,0 MW, 0.2um filtrada) durante a preparação.
- Calcular a quantidade necessária de quitosana para 10μg PDNA desejado de acordo com relação N / P, a relação teórica de aminas protonadas na solução de quitosana para os fosfatos negativa na solução de DNA.
- Adicionar estreptavidina-funcionalizados 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) para a solução PDNA biotinilado.
- Incubar a solução à temperatura ambiente no escuro por 15 min.
- Adicione o DNA-QD rotulados em 50 solução de sulfato de sódio mM para fazer a 200μL volume final.
- Diluir Cy5-quitosana, de acordo com a desejada relação N / P, com água Milli-Q para fazer a 200μL volume final.
Nota: Mantenha a reação no escuro para evitar fotobranqueamento possível.
Importante: Tenha cuidado ao usar o Qdot 605 ITK ™ estreptavidina conjugada (a série ITK), como pontos quânticos neste catálogo são projetados com a finalidade de FRET. A série Qdot regulares são conjugados com uma camada de PEG para evitar ligações não específicas, especialmente para a rotulagem celular. No entanto, essa camada adicional aumenta a distância doador receptor, resultando em reduced eficiência da transferência de energia.
D. Fabricação do SU-8 Mestres usando fotolitografia padrão
- Wafer Si é piranha limpo e cozido a 200 ° C por 5 min.
- Para a espessura de 25μm mestre designado, casaco girar o fotorresiste negativo (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA), em Si wafer a 2000 rpm por 30 seg.
- Bake suave a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C.
- Exponha à luz UV (365 nm) para 250mJ/cm 2 a máscara de um filme (CAD / Art Services, Bandon, OR), contendo o projeto de microcanais.
- Pós-exposição cozer a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C.
- Desenvolver o wafer usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste.
- O wafer é difícil cozido estampados numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / h até 200 ° C. Manter o wafer de 200 ° C por pelo menos 5 horas, então, gradualmente, esfriar a bolacha até à temperatura ambiente.
Importante: rampa gradual durante o SU-8 processo de cozimento mestre é necessário, caso contrário, o SU-8 estrutura pode destacada do wafer de silício ou fissuras na estrutura do SU-8 pode ser induzida pelo estresse de liberação.
E. Moldagem Réplica de PDMS com os mestres e União para a tampa de vidro
- O mestre SU-8 é colocado em um barco de pesagem.
- Mix de silicone elastômero e agente de cura (Poli (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI), em um 10: 1 ratio.
- Despeje a mistura sobre o PDMS mestre SU-8 e deixar o barco pesa num exsicador de vácuo para remover as bolhas.
- Curar o PDMS a 65 ° C por 1-2 horas.
- Descasque a tira PDMS do molde mestre Si.
- Entradas e saídas de soco canal do dispositivo fluídico.
- Limpe a tira de PDMS e tampa de vidro com etanol e, em seguida, secar ao ar.
- Tratar a limpo PDMS tiras e tampa de vidro com plasma de oxigênio (20W por 1min).
- Imediatamente tira o vínculo PDMS com tampa de vidro.
- Deixe o chip colado microfluídicos no forno a 95 ° C para pernoite.
Importante: O tratamento do plasma e assar durante a noite são essenciais para a força de ligação reforçada.
F. Monitorar a formação de DNA Nanocomplexes No dispositivo micro
- Preencha o canal microfluídicos com água (para garantir que não haja bolhas dentro do canal microfluídicos), antes de carregar os reagentes para garantir fluidez durante o experimento.
- Carregar o DNA QD-rotulados e Cy5 marcado quitosana soluções em duas seringas de vidro individuais, através da tubulação descrito no vídeo.
- Conecte o tubo com as duas entradas de dispositivos microfluídicos. Ser cautelosos para não introduzir qualquer ar durante o processo. Definir a taxa de fluxo em 20nL/min (PHD-2000 bomba de seringa, Holliston, MA), sob condições de fluxo laminar.
- Verifique os microcanais sob o microscópio.
- Quando o fluxo é estável (~ 15 a 20 minutos), QD-mediada FRET devem ser observadas no centro do canal.
- Tirar fotos de fluorescência (CCD refrigerado, Qimaging, BC, Canadá) em diferentes locais ao longo do canal.
- Analisar as imagens de fluorescência com ImageJ e OriginLab.
Figura 1. QD-FRET fornece uma indicação sensível do início da Nanocomplexes DNA auto-montagem
- Quantum dot-mediada transferência de energia de ressonância de fluorescência (QD-FRET) pode fornecer uma indicação quantitativa e altamente sensível de estabilidade Polyplex em qualquer ambientes extra-ou intra-celular, permitindo a detecção inequívoca do início das interações entre o DNA eo portador do gene. O par FRET, 605QD e Cy5, foi escolhido com base na maximização sobreposição espectral entre o doador eo receptor e minimizar o potencial cross-talk. Para este par, a distância é 69.4Å Förster. 3
- Auto-montagem do nanocomplexes QD-FRET DNA. DNA plasmídeo aniônicos (PDNA) ea transportadora gene catiônicos foram marcadas com QD (doador de energia) e Cy5 (energia aceitante), respectivamente. QD-FRET nanocomplexes foram formados através de coacervação complexa eletrostática. Após a excitação a 488 nm, QD-FRET mediada emissão Cy5 indicado formação de um nanocomplex compacto e intacta. O tempo de permanência (t R) pode ser calculado de acordo com a distância (x) que mede a partir de onde as duas correntes se encontram para a posição de reação sob investigação, ea velocidade média do fluxo (v). Devido à natureza do fluxo laminar, mistura só ocorre na interface (centro de cada imagem), permitindo o cálculo preciso de transporte de massa em função de t R. A resolução temporal pode ser ajustada pela variação da applietaxas de fluxo d. (Inset) FRET mediada por sinal foi observada imediatamente na interface, quando as duas correntes atendidas, indicando que a ligação foi rápida, ocorrendo dentro de alguns milissegundos de acordo com as taxas de fluxo aplicadas. Bar escala: 100μm.
Discussion
- Importância do nosso trabalho:
- Esta é a primeira tentativa de monitorar poliméricos DNA nanocomplex auto-montagem cinética em tempo real (milissegundo resolução) através QD-FRET respostas dentro de um chip simples microfluídicos.
- QD-mediada FRET fornece uma indicação altamente sensível e quantitativa do aparecimento de interações moleculares e em todo o processo de auto-montagem, enquanto que a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo durante a síntese nanocomplex DNA.
- A integração de microfluídica e nanofotônica sugere uma abordagem nova e interessante investigar qualquer tipo de reações de complexação.
- O resultado QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função 1,2.
Acknowledgments
Apoio financeiro fornecido pelo NIH conceder HL89764, NSF concede 0546012, 0730503 e 0725528.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor. Nat Mat. 4, 826-831 (2005).
