Summary
Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.
Abstract
Advances in Genomik weiterhin die Entwicklung von Therapeutika, die Pathogenese auf zellulärer und molekularer Ebene Ziel-Kraftstoff. In der Regel funktionale innerhalb der Zelle, benötigen Nukleinsäure-basierten Therapeutika eine effiziente intrazelluläre Delivery-System. Ein weit verbreiteter Ansatz besteht darin, komplexe DNA mit einem Gen Träger Nanokomplexen über elektrostatische Selbstorganisation bilden, erleichtert die zelluläre Aufnahme von DNA und schützt es vor dem Abbau. Die Herausforderung liegt darin das rationale Design von effizienten Gen-Trägern, da vorzeitige Dissoziation oder übermäßig stabile Bindung würde sich nachteilig auf die zelluläre Aufnahme und therapeutische Wirksamkeit. Nanokomplexen durch Masse mischen synthetisiert zeigte ein breites Spektrum von intrazellulären Auspacken und Menschenhandel Verhalten, das der Heterogenität in Größe und Stabilität der Nanokomplexen zugeschrieben wurde. Solche Heterogenität erschwert die genaue Beurteilung der self-assembly Kinetik und fügt zu der Schwierigkeit bei der Korrelation von ihren physikalischen Eigenschaften Transfektionseffizienz oder Bioaktivitäten. Wir präsentieren ein neuartiges Konvergenz der Nanophotonik (dh QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Echtzeit-Kinetik der nanocomplex self-assembly unter Laminar Flow zu charakterisieren. QD-FRET bietet einen hochempfindlichen Hinweis auf das Auftreten von molekularen Wechselwirkungen und quantitative Messung während der Synthese, während Mikrofluidik bietet eine gut kontrollierte Mikroumgebung räumlich analysieren den Prozess mit hoher zeitlicher Auflösung (~ Millisekunden). Für das Modellsystem der polymeren Nanokomplexen, wurden zwei unterschiedliche Phasen in den Self-Assembly-Prozess durch diese analytische Plattform erfasst. Die kinetische Aspekt der Selbstorganisation auf der Mikroebene erhalten würden als besonders wertvoll für Mikroreaktor-basierte Reaktionen, die für viele Mikro-und Nano-Anwendungen sind. Ferner kann Nanokomplexen durch richtige Gestaltung der microfludic Geräte angepasst werden, und die daraus resultierenden QD-FRET polymeren DNA Nanokomplexen leicht könnte für die Errichtung Struktur-Funktions-Beziehungen angewendet werden.
Protocol
A. Biotinylierung von DNA
Plasmid-DNA wurden kovalent mit Guanin-spezifischen Biotin-Markierungen, wie vom Hersteller (Mirus Bio, Madison, WI) beschrieben, aber skaliert auf ~ 1-2 Biotin Etiketten pro DNA haben biotinyliert. Plasmid-DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) wurde in diesem Protokoll bezeichnet.
- Lösen Sie gewünschte Menge pDNA in TE-Puffer von DNase-frei und RNase-frei (Molekularbiologie-Qualität) Wasser zu einem 1μg/μL DNA-Lösung zu machen.
- Conduct der Kennzeichnung Reaktion unter Verwendung des folgenden Reaktionsmischungen. Fügen Sie die Label IT dauern.
Für 100 &mgr; g DNA Reaktion:
| DNase-frei und RNase-freies Wasser | 75 &mgr; l |
| 10X Labeling Puffer A | 20 ul |
| 1μg/μL DNA | 100 ul |
| Label IT | 5 ul |
| Gesamtvolumen | 200 ul |
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Purify der markierten Probe mit Ethanol oder Isopropanol-Fällung nach Standardprotokollen.
Hinweis: Die Gelfiltration auf Spalten zu hohen UV-Absorption oder Fluoreszenz-Hintergrund, die die DNA-Quantifizierung oder Fluoreszenz Charakterisierung beeinträchtigen können.
Hinweis: Die Höhe der Biotinylierung kann HABA-Tests ermittelt werden.
B. Kennzeichnung der Cy5-kationisches Polymer
Chitosan (390 kDa, 83,5% deacetylierte, Vanson, Redmond, WA) wurde als Modell kationischen Polymer in dieser Studie verwendet. Die freie primäre Amine auf das Chitosan Polymerrückgrat wurden mit Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) gekennzeichnet.
- Zur Erleichterung der vollständigen Konjugation von Cy5-Farbstoff, berechnen die erforderliche Menge von Cy5-NHS, dass das molare Verhältnis von Cy5: 200: primäre Amine 1 ist.
- Der pH-Wert der Chitosan-Lösung (in 25 mM Acetatpuffer) bis ~ 6,5 durch Zugabe von NaOH. Beachten Sie, dass der NHS Reaktion effizienter ist bei basischen pH-Wert, aber die Löslichkeit von Chitosan hier Grenzen der Arbeits-pH-Bereich.
- Unter Rühren langsam das berechnete Menge an Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO), um die Chitosan-Lösung in einem Drop-by-drop Weise.
- Man schüttelt die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht.
- Zur Reinigung mit 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) für 2 h dialysiert gegen 1% Acetatpuffer bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Ersetzen Puffer und dialysieren weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Ersetzen Puffer und dialysieren über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln.
- Shop gereinigtes markiertes Polymer bei -20 ° C.
Hinweis: In dieser Studie wurde ein Standard-Kurve wird durch die Messung der Emissionsintensität Cy5-NHS-Ester bei 670 nm hergestellt. Charakterisieren Sie die Kennzeichnung Dichte durch Messung der erhaltenen Emission bei 670 nm aus Cy5-markierte Chitosan in der Standardkurve. Die Absorption kann auch verwendet werden, um die Kennzeichnung Effizienz zu bestimmen, wurde aber hier nicht durchgeführt.
C. Herstellung von QD-markierte DNA-und Cy5-Polymer
Das Molverhältnis von pDNA zu QD wurde im Überschuß gehalten (pDNA: QD ≈ 1: 2) zum vollständigen Konjugation von QDs zu pDNA zu gewährleisten. Die Zahl der QDs auf jeden pDNA gekennzeichnet durch TEM-Aufnahmen oder andere gleichwertige Einrichtungen geschätzt werden. In unserer Studie ist die Zahl der QDs pro pDNA schätzungsweise ~ 1-3 von TEM und Einzelmolekül-Spektroskopie. 1 Verwenden Millipore Milli-Q Gradient Wasser (> 18,0 MW, 0.2um gefiltert) während der Vorbereitung.
- Berechnen Sie die erforderliche Menge von Chitosan für 10 ug pDNA nach gewünschten N / P-Verhältnis, das theoretische Verhältnis von protonierten Aminen in der Chitosan-Lösung, um die negativen Phosphate in die DNA-Lösung.
- Add Streptavidin-funktionalisierten 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) in den biotinylierten pDNA Lösung.
- Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 15 min.
- Fügen Sie die QD-markierte DNA in 50 mM Natrium-Sulfat-Lösung auf das Endvolumen 200 ul zu machen.
- Verdünnen Cy5-Chitosan, je nach gewünschter N / P-Verhältnis, mit Milli-Q-Wasser auf das Endvolumen 200 ul zu machen.
Hinweis: Halten Sie die Reaktion im Dunkeln, um mögliche Ausbleichen zu verhindern.
Wichtig: Seien Sie vorsichtig, um die Qdot 605 ITK ™ Streptavidin-Konjugat (die ITK-Serie), wie Quantenpunkte in diesem Katalog für die Zwecke der FRET ausgelegt sind. Die regelmäßige Qdot Serie konjugiert sind mit einer PEG-Schicht, um die unspezifische Bindung zu verhindern, vor allem für die zelluläre Markierung. Allerdings vergrößert sich diese zusätzliche Beschichtung der Donor-Akzeptor-Abstand, was zu reduced Energieübertragungseffizienz.
D. Herstellung der SU-8 Masters Verwendung von Standard-Photolithographie
- Si-Wafer ist Piranha gereinigt und gebacken bei 200 ° C für 5 min.
- Für die ausgewiesenen Meister Dicke von 25 um, Spin Mantel der negativen Photoresist (SU-8 2025 Microchem, Newton, MA) auf Si-Wafer bei 2000 rpm für 30 sek.
- Softbake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C.
- Expose mit UV-Licht (365nm) für 250mJ/cm 2 durch eine Maske Film (CAD / Art Services, Bandon, OR) mit dem Design von Mikrokanälen.
- Post-Exposure Bake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C.
- Entwickeln Sie die Wafer mit SU-8 Fotolack-Entwickler.
- Die strukturierten Wafer ist hart auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C gebacken / h bis 200 ° C. Pflegen Sie die Wafer bei 200 ° C für mindestens 5 Stunden, dann allmählich kühler der Wafer auf Raumtemperatur.
Wichtig: Schrittweise Rampe während des SU-8 Master Backprozess ist notwendig, da sonst die SU-8-Struktur kann aus dem Silizium-Wafer oder Risse an löste die SU-8-Struktur kann durch Stress-release induziert werden.
E. Replica Molding von PDMS von den Meistern und Bonding, um das Deckglas
- Die SU-8-Master ist in eine Abwägung Boot gelegt.
- Mix Silikon-Elastomer und Härter (Poly (dimethylsiloxan), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in einem 10: 1-Verhältnis.
- Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die SU-8-Master und lassen Sie das Gewicht von Boot in einem Vakuum-Exsikkator, um Luftblasen zu entfernen.
- Cure die PDMS bei 65 ° C für 1-2 Stunden.
- Schälen Sie die PDMS Streifen aus dem Si Master-Form.
- Punch-Kanal Ein-und Auslässe der fluidischen Gerät.
- Reinigen Sie die PDMS-Streifen und Deckglas mit Ethanol und anschließend an der Luft trocknen.
- Behandeln Sie den gereinigten PDMS-Streifen und Deckglas mit Sauerstoff-Plasma (20W für 1min).
- Unmittelbar Bindung der PDMS-Streifen mit Deckglas.
- Lassen Sie die verklebten Mikrofluidik-Chip in den Ofen bei 95 ° C über Nacht.
Wichtig: Plasma-Behandlung und Übernachtung Backen sind unerlässlich, um verbesserte Haftfestigkeit.
F. Überwachung der Bildung von DNA Nanokomplexen In der Mikrofluidikvorrichtung
- Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal mit Wasser (um sicherzustellen, gibt es keine Blasen innerhalb der mikrofluidischen Kanal), vor dem Laden der Reagenzien reibungslosen Ablauf während des Experiments zu gewährleisten.
- Laden Sie die QD-markierte DNA-und Cy5-markierte Chitosan-Lösungen in zwei einzelnen Glasspritzen, durch den Schlauch in das Video beschrieben.
- Schließen Sie den Schlauch mit den beiden Eingängen der mikrofluidischen Bauteilen. Seien Sie vorsichtig, nicht, um die Luft während des Prozesses vorstellen. Stellen Sie den Durchfluss bei 20nL/min (PHD-2000 Spritzenpumpe Holliston, MA), unter Laminar-Flow-Bedingungen.
- Überprüfen Sie die Mikrokanäle unter dem Mikroskop.
- Wenn die Strömung stabil (~ 15 bis 20 Minuten), FRET QD-vermittelte sollte in der Mitte des Kanals beobachtet werden.
- Nehmen Fluoreszenz Bilder (gekühlte CCD, Qimaging, BC, Canada) an verschiedenen Orten entlang des Kanals.
- Analysieren Sie die Fluoreszenzbilder mit ImageJ und OriginLab.
Abbildung 1. QD-FRET bietet ein empfindlicher Indikator für das Auftreten von DNA Nanokomplexen self-assembly
- Quantum dot-vermittelte Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (QD-FRET) kann ein quantitativer und hochempfindlicher Angabe Polyplex Stabilität in entweder extra-oder intrazellulären Umgebungen zu schaffen, der für eine eindeutige Erkennung des Beginns der Wechselwirkungen zwischen DNA und das Gen Träger. Die FRET-Paar, 605QD und Cy5, wurde basierend auf der Maximierung spektrale Überlappung zwischen den Donor-und Akzeptor und zur Minimierung potentieller cross-talk gewählt. Für dieses Paar ist der Förster Distanz 69.4Å. 3
- Self-Assembly der QD-FRET DNA Nanokomplexen. Anionische Plasmid-DNA (pDNA) und dem kationischen Gen Träger wurden mit QD (Energie-Donor) und Cy5 (Energie-Akzeptor) markiert jeweils. QD-FRET Nanokomplexen wurden durch elektrostatische Komplexkoazervation gebildet. Nach Anregung bei 488 nm, angegeben QD-FRET-vermittelte Cy5-Emission Bildung einer kompakten und intakte nanocomplex. Die Verweilzeit (t R) kann je nach der Entfernung (x), welche, von wo aus die beiden Ströme, um die Position der Reaktion untersucht, und die mittlere Strömungsgeschwindigkeit (v) treffen Maßnahmen berechnet werden. Aufgrund der Beschaffenheit der laminaren Strömung, Vermischung erfolgt nur an der Schnittstelle (Mitte jedes Bild), die eine genaue Berechnung der Stofftransport in Abhängigkeit von t R. Zeitliche Auflösung kann durch Variation der applie eingestellt werdend Flussraten. (Inset) FRET-vermittelten Signaltransduktion wurde sofort an der Schnittstelle, wenn die beiden Ströme trafen beobachtet, was darauf hinweist, dass die Bindung war schnell, innerhalb von wenigen Millisekunden nach dem angewandten Flussraten. Maßstab: 100 um.
Discussion
- Die Bedeutung unserer Arbeit:
- Dies ist der erste Versuch, polymeren DNA nanocomplex self-assembly-Kinetik in Echtzeit (Millisekunden-Auflösung) durch QD-FRET Antworten Monitor in einem einfachen Mikrofluidik-Chip.
- QD-vermittelte FRET bietet eine hoch empfindliche und quantitative Angabe der Beginn der molekularen Wechselwirkungen und in der self-assembly-Prozess, während Mikrofluidik bietet eine gut kontrollierte Mikroumgebung räumlichen Analyse der Prozess während der DNA-Synthese nanocomplex.
- Die Integration von Mikrofluidik und Nanophotonik schlägt einen neuen und interessanten Ansatz, um jede Art von Komplexierung Reaktionen zu untersuchen.
- Die daraus resultierende QD-FRET polymeren DNA Nanokomplexen konnte leicht für die Errichtung Struktur-Funktions-Beziehungen angewendet werden. 1,2
Acknowledgments
Finanzielle Unterstützung durch die NIH HL89764, NSF Zuschüsse 0546012, 0730503 und 0725528 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H.
