Summary
Wir beschreiben ein Verfahren mittels Laser-Mikrodissektion zu isolieren und zu extrahieren RNA aus einer homogenen Zellpopulation, pyramidalen Neuronen in der Schicht III des oberen temporalen Gyrus in postmortalen menschlichen Gehirnen. Wir anschließend linear verstärken (T7-based) mRNA und hybridisieren die Probe auf die Affymetrix menschlichen X3P Microarray.
Abstract
Wir schlugen vor, die graue Substanz Reduzierung der oberen temporalen Gyrus bei Schizophrenie-Patienten gesehen zu untersuchen, durch Abfrage Genexpressionsprofile Pyramidenneuronen in Schicht III. Es ist bekannt, dass die Großhirnrinde einen außergewöhnlich heterogene Struktur aus unterschiedlichen Regionen, Schichten und Zelltypen, die jeweils durch verschiedene zelluläre und molekulare Zusammensetzung und somit differenziellen Genexpression Profile gekennzeichnet ist. Zur Umgehung der verwirrenden Wirkungen einer Gewebekultur Heterogenität, haben wir Laser-Mikrodissektion (LCM), um unsere spezifischen Zelltyp dh Pyramidenneuronen isolieren.
Etwa 500 Pyramidenneuronen mit dem Histogene Färbelösung gefärbt wurden unter Verwendung des Arcturus XT LCM-System. RNA wurde dann von eingefangenen Zellen isoliert und unterzog sich zwei Runden T7-basierte lineare Verstärkung mit Arcturus / Molecular Devices Kits. Die Experion LabChip (Bio-Rad)-Gel und Elektropherogramm angegeben guter Qualität a (m) RNA, eine Abschrift Länge erstreckt Vergangenheit 600nt für Microarrays erforderlich. Die Menge der mRNA erreicht durchschnittlich 51μg, mit akzeptablen Mittelwert Probenreinheit wie von der A260/280 Ratio von 2,5 angegeben. Die Genexpression wurde profiliert mit dem Human X3P GeneChip Sondenarray von Affymetrix.
Protocol
1) Tissue Schnitte:
Wir erhalten die notwendigen Gewebe (Kontrolle n = 9, Schizophrenie n = 9) von der Harvard Gehirngewebe Resource Center, abgestimmt auf Alter, Geschlecht und postmortalen Intervall (PMI) (Tabelle 1). Flüssiger Stickstoff Dampf Blöcke wurden ca. 3mm dick aus Brodmann-Areal 42 (Gyrus temporalis superior) aufgenommen wurden.
Vor Beginn der Färbung von pyramidalen Neuronen, müssen die Bedingungen optimiert, um eine optimale Gewebe "lift" und eine hohe RNA-Qualität zu erhalten. Tissue "lift" beschreibt den Prozess während der Laser-Mikrodissektion, wo die Neuronen für die Aufnahme markiert, um die Kappe haften und werden getrennt, während die übrigen Gewebe zurückgelassen wird.
Optimierung:
- Zur Verringerung der RNase-Aktivität, die RNA-Qualität Kompromisse, behandeln alle Oberflächen, einschließlich der Arbeitsbereich, Schneiden Messer und Dias mit einer RNase-Dekontamination Lösung, wie RNase Zap, zusätzlich zu Abwischen mit 100% Ethanol.
- Section des Gewebes mit dem Kryostaten bei -17 ° C eingestellt Dies reduziert das Temperaturgefälle zwischen Raumtemperatur (Folien), der Kryostat und das Trockeneis (siehe gesamten Prozess weiter unten). Wenn die Temperatur unter -20 ° C, neigen die Gewebeschnitte zu zerreißen, wodurch sie unbrauchbar werden. Höher, und der Temperaturgradient steigt, die RNA-Integrität beeinträchtigen können.
- Die Abschnitte sollten 8μm dick, als dickere Abschnitte letztlich Kompromisse Gewebe "lift". Diese Dicke ermöglicht auch eine korrekte Identifizierung von pyramidalen Neuronen für die Erfassung.
- Verwenden Sie Normalpapier ungeladenen Objektträgern (zB Histogene LCM Dias), da diese nicht mit dem Gewebe "Lift" in der Laser-Capture-Verfahren einmischen. Membrane Dias können auch verwendet werden, aber diese sind besser geeignet zur Isolierung großer Gewebestrukturen, wie die Membran neigt dazu, leicht anheben während der Laser-Capture-Verfahren, wodurch die Infrarot-(IR) Messfleck und sinkenden Zell-Spezifität.
- Montieren Sie zwei Abschnitte pro Objektträger aus Glas, da mehr als zwei Abschnitte pro Folie konnte RNA-Qualität durch die ständige Variation Kompromiss der Temperatur während des Schneidens die.
- Nach dem Anschneiden, platzieren Sie den Objektträger sofort in ein Mikro schiebeschachtel auf Trockeneis, um RNA-Integrität zu bewahren. Slide-Boxen mit den Hirnschnitten werden anschließend bei -80 ° C bis zur Verarbeitung.
Wir haben bereits festgestellt, dass für Pyramidenneuronen, 500 Zellen pro Fall angemessen sind, um genügend RNA für die Microarray-Hybridisierung zu erwerben. Etwa vier Abschnitte sind pro Fall notwendig, vor allem wegen dem Schneiden und Färben Artefakte.
2) Färbung von pyramidalen Neuronen:
Identifizierung von pyramidalen Neuronen mit dem Histogene schnellen Farblösung und Kit erreicht, da es uns, diese Neuronen sichtbar zu machen, ohne bei längerer Exposition zu wässrigen Lösungen und damit die Erhaltung RNA ermöglicht.
- Bereiten Sie sich für die Färbung durch Zugabe von 1μl RNase-Inhibitor pro 100 &mgr; l der Färbelösung (zB Promega), um die RNase-Aktivität zu begrenzen. Vier Abschnitte (2 Folien), erfordern 4μl von RNase-Inhibitor hinzugefügt 400μl der Histogene Färbelösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (auf Eis gehalten). Für jeden Abschnitt, verwenden wir 97μl dieser Lösung, die uns eine angemessene Fleck Pyramidenneuronen identifizieren.
- Bereiten Sie Dehydration Serie und Xylol: aliquoten 25ml der entsprechenden ethanole in die Küvetten mit den Histogene Kit, also 2x75%, 95%, 100% und 2 Gläser RNase-freies Wasser zur Verfügung gestellt. Legen Sie alle Gläser in einem Eiskübel, mit Ausnahme eines 75% jar, die Sie in der -20 ° C Gefrierschrank. Unter einem Abzug, fügen Molekularsieben in die Xylol jar, um überschüssiges Wasser, das Gewebe "lift" Kompromiss könnten, zu entfernen.
- Schalten Sie das Wasserbad (oder Wärme-Block) mit der eingestellten Temperatur auf 42 ° C und setzen Sie ein 50ml Falcon-Röhrchen von einem Rack im Wasserbad unterstützt.
- Nehmen Sie zwei Folien von -80 ° C und Auftauen sie auf einem Kimwipe für ca. 30 Sekunden, oder einfach nur, bis die Ecken der Folien Abtauung.
- Kurz fix Folien in der 75% Ethanol für 30 Sekunden in der -20 ° C Gefrierschrank. Übertragen Sie die Folien zwischen Küvetten mit RNase-zapped Pinzette zur Verringerung der Kontaminierung.
- Nach 30 Sekunden waschen in Nuklease-freies Wasser, können die Abschnitte mit einem PAP-Schranke Stift skizziert werden, um die Lösung einzuengen Abschnitt jedoch mit der Ebene Glasträger dies nicht unbedingt erforderlich ist.
- Stain die vier Abschnitte mit den Histogene Färbelösung für 20 Sekunden, mit 97μl des Flecks / RNase-Inhibitor pro Abschnitt. Anschließend trocknen die Teile in die zuvor vorbereiteten ethanole auf Eis für 30 Sekunden pro Schritt. Die letzte 100% Ethanol Schritt sollte bis 3 Minuten verlängert werden, Um eine ausreichende Austrocknung für ausreichende Gewebe "Lift" zu erreichen und erfassen auf dem LCM caps.
- Tauchen Sie die Objektträger in Xylol für 5 Minuten und an der Luft trocknen in einem Dunstabzug für weitere 5 Minuten vor der Aufnahme.
Die Färbung Schritte sollten nur durchgeführt werden, wenn Laser-Capturing unmittelbar danach. Alle Lösungen sollten alle 4-6 Dias geändert werden, um eine Kontamination zu verhindern und um eine ordnungsgemäße Entwässerung zu gewährleisten.
3) Einzel-Zelle Laser-Mikrodissektion:
Nach der Färbung werden Pyramidenneuronen aus der Schicht III entfernt mittels Laser-Mikrodissektion, mit dem Arcturus XT System-und Software. Kurz gesagt, funktioniert das System durch Pulsieren einer einstellbaren Stärke IR-Laser durch eine thermoplastische Folie an der Unterseite eines Deckels befindet sich in der Verlängerung / Dehnung der Film direkt auf die Zellen von Interesse. Wenn die Kappe aus dem Gewebe wird angehoben, bleiben die Zellen aufgenommen / Nachzucht auf der Kappe. Eine bildliche Zusammenfassung ist in Abbildung 1 dargestellt.
Vor Beginn dieser Prozedur ist es wichtig, zwischen den beiden Arten von Kappen mit diesem System zu unterscheiden. Während die Macro CapSure Kappe ist in der Regel für die Erfassung von größeren Gewebe-Strukturen verwendet werden, sind die CapSure HS Kappen entworfen, um eine kleine Anzahl von einzelnen Zellen erfasst und deshalb diese Kappen haben eine kleinere Fläche für die Aufnahme bezeichnet. Die HS caps auch Schienen, die Kappe von in direktem Kontakt mit dem Gewebe Abschnitt zu verhindern, während die Makro-Kappe nicht. Diese Schienen die Wirkung von Gewebe Falten, die Auswirkungen auf oder kann zu Schwankungen der Spot-Größe (des Laserpulses) als Macro Kappe sitzt direkt auf gefaltet, unebene Gewebe. Für unser Verfahren haben wir den HS caps, um die Vorteile ihrer Fähigkeit, die Wirkung von Gewebe Falten reduzieren zu nehmen, behielt aber die Makro-cap-Einstellungen über die Software, um die erfassten Bereich zu maximieren, da wir die Erfassung einer großen Anzahl von Zellen sind.
- Legen Sie die Folien und Verschlüsse auf die Arcturus XT Apparat. Verwenden Sie die CapSure HS Kappen, aber halten Sie die Programm-Einstellung auf Makro. Klicken Sie auf das Kästchen "Load mit Überblick", um einen Überblick Foto von jeder Folie zu erhalten.
- Stellen Sie die Helligkeit / Fokus auf 2x Vergrößerung, um zu bestimmen, welcher Bereich wäre optimal für die Laser-capture. Vermeiden Sie Gewebeschnitte mit einem übermäßigen Falten, sondern wählen Abschnitte intakt, glatt und gefärbt gut, vor allem in der Nähe der Region von Interesse, dh Schicht III.
- Wir platzieren eine Kappe über den allgemeinen Bereich, wo wir zu erfassenden, achten Sie darauf, Schicht III gehören. Noch im 2-facher Vergrößerung, stellen Sie sicher, dass die Kappe Schienen nicht auf jedem Falten Rest ist, wie dies die Kappe kippen wird.
- Anschließend bestätigen wir die Lage der IR-Laser Spot manuell am 40-facher Vergrößerung. Wenn die Stelle (roter Strahl) nicht mit dem blauen Kreuz korrelieren, kann dies mit der rechten Maustaste auf der Stelle und wählen Sie "befindet IR-Spot" eingestellt werden.
- Bei 40x, können wir beginnen, Pyramidenneuronen nach folgenden Kriterien zu identifizieren (1) Zellen, die pyramidenförmig sind und (2) den proximalen Teil des apikalen und / oder basalen Dendriten erkennbar sind (Abb. 1A).
Wir haben jetzt passen Sie die Leistung und die Dauer des Laserpulses, um die pyramidenförmigen Neuronen zu erfassen. Dies ist besonders wichtig, da es die Spezifität der Zelle neben der Anzahl der Zellen gefangen gefangen bestimmt. Wenn der Puls ist zu schwach, nicht alle identifizierten Neuronen wird erfasst, während, wenn der Puls zu stark sie erfassen könnte das umliegende Gewebe / Zellen anders als das Neuron allein. Im Allgemeinen mit dem Gewebe und Zellen Spezifikationen hier verwendete Laser Stärke (70mW) und Dauer (16msec) führen zu einem Spot-Größe von 25 um etwa im Einklang mit pyramidenförmigen Neuron Größe (Abb. 1B). Allerdings sind diese Einstellungen fein abgestimmt auf jeden einzelnen Abschnitt, um etwa den gleichen Spot-Größe pro Fall erhalten. Wenn "lift" gefährdet ist, kann man immer erhöhen die Anzahl der Zellen erfasst, um die Menge an RNA, die aus jeweils vergleichbar erhalten bleiben. Allerdings sollten Sie Ihre Zeit erfassen, einschließlich Färbung behalten unter 1,5 Stunden, länger als diese kann RNA Qualität keine Kompromisse.
- Speichern Sie zuerst die Position der Kappe, indem Sie auf das Pluszeichen an der Position-Funktion. Auf diese Weise, wenn wir aus irgendeinem Grund die Kappe entfernen müssen und dann müssen sie wieder auf den gleichen Ort, wird die Kappe immer auf genau die gleiche Stelle zurück, dass Sie die Punktgröße für eingestellt.
- Geben Sie diese Werte in das Steuergerät: 70 in Strom und 16 in Dauer. Deaktivieren Sie das "auto bewegen stage"-Option, und stellen Sie sicher, dass die richtige Größe Symbol mit dem Symbol auf dem Panel auf der rechten Seite korreliert.
- Wählen Sie den Kreis-Option (unten rechts) zu einem Neuron, die Sie gerne Capture-Test würde wählen, und aktivieren Sie den Laser, indem Sieauf "test IR-Spot".
- Der Spot mit dem Laser werden sollten einerseits eine klare dunklen Ring um das Objekt erfasst. Wenn dieser Ring ist zu hell, wurde die Zelle nicht erfasst. Wenn es einen dunklen Fleck in der Mitte des dunklen Ring, dann ist die Laser-Stärke / Dauer zu groß, und es könnte einen negativen Effekt auf die RNA in der Zelle gefangen haben. Stellen Sie sicher, dass der Ring groß genug, um die Zelle umfassen, aber klein genug, dass es nicht auch unerwünschtes Gewebe oder andere Zellen.
- Wiederholen Sie den Vorgang auf verschiedene Teile des Gewebes innerhalb der Schicht, das Sie aufnehmen wollen, um zu überprüfen, dass die Spot-Größe nicht unterscheiden sich je nach Standort. Passen Sie entsprechend.
- Sobald der Laserpunkt eingestellt worden ist, weiterhin Pyramidenneuronen für die Aufnahme zu identifizieren. Wir identifizieren ca. 500 Zellen pro Probe, die in etwa 500PG von Gesamt-RNA pro Probe ergibt. Wir haben auch in der Regel nur einen Abschnitt, um die Menge der Aufnahme zu reduzieren, da die Kappe muss für jeden Abschnitt neu eingestellt werden. Sobald Sie haben alle Zellen, die Sie brauchen identifiziert, drücken Sie die Laser-Capture-Taste und alle Ihre Zellen werden automatisch auf die Kappe (Abb. 1C) erfasst werden.
- Sobald alle Zellen eingefangen worden sind, bewegen Sie den Deckel zu einem anderen Teil der Folie, die nicht enthält einen Abschnitt. Gehen Sie zurück zu, wo die Zellen wurden gefangen genommen und stellen Sie sicher, dass mindestens 90% der Neuronen entfernt wurden. Wenn nicht, versuchen Sie nicht, die gleichen Zellen wieder einzufangen, aber suchen Sie das Gebiet, wo die meisten Zellen aufgenommen wurden und erfassen mehr Zellen in der gleichen Gegend. Bewegen Sie die Kappe an der QC-Station.
- Setzen Sie die Kappe in die 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen von Applied Biosystems (Kat. # N8010611) mit 50 ml Extraktionspuffer (PicoPure RNA Isolation Kit). Die Kappe wurde entwickelt, um perfekt in dieser speziellen Rohr-Puffer aus undichten verhindern.
- Drehen Sie die Einheit auf den Kopf, um sicherzustellen, dass Extraktionspuffer die gesamte Kappe bedeckt, und legen Sie sie am unteren Rand der 50ml Falcon-Röhrchen bereits im Wasserbad gesetzt bei 42 ° C Die Neuronen sind für 30 Minuten inkubiert, um das Gewebe aus der Kappe zu entfernen.
- Danach Zentrifuge das Rohr und Kappe Montage für 2 Minuten bei 800 g. Entfernen Sie den Deckel und bewahren Sie die restlichen Zellextrakt bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion. Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme können Sie überprüfen die Kappe an der QC-Station auf dem Laser-Capturing Gerät, um sicherzustellen, dass alle Neuronen aus der Kappe selbst entfernt wurden.
4) Beziehen RNA aus speziellen neuronalen Populationen:
Man kann direkt von der Aufnahme in die Isolation oder Tauwetter die Probe in der -80 ° C Gefrierschrank gelagert. In unserem Experiment haben wir zunächst gesammelt alle Proben benötigt und gespeichert ihnen bei -80 ° C, bevor die Isolation RNA.
RNA-Isolierung erfolgt mit dem PicoPure Isolation Kit, das entworfen, um eine kleine Anzahl von Zellen aus LCM-Proben zu isolieren und low-Fülle mRNA behalten wird. Generell verfolgen wir das Protokoll, mit dem Kit enthalten ist. Nachfolgend geben wir eine grundlegende Beschreibung des Prozesses.
- Nach dem Auftauen mit 70% Ethanol (im Lieferumfang des Kits) und Zentrifuge auf einer konditionierten Reinkolonne, um die RNA an die Säule Filter binden.
- Nach dem Waschen behandeln die RNA mit DNase, um eine vollständige Entfernung der DNA sicherzustellen, um das Risiko von DNA zu eliminieren. Dieser Schritt ist besonders wichtig in den nachgelagerten Anwendungen wie Echtzeit-qRT-PCR.
- Im Anschluss an die DNA zu verdauen, gibt es einen weiteren Waschschritt getrennt. Überprüfen Sie, dass kein Waschpuffer in der Spalte vor der Übertragung auf ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen bleibt, wie jede Gegenwart des Puffers in die endgültige Probe in weniger Ausgangs-RNA für die Amplifikation führt. Um dies zu gewährleisten, Zentrifuge wir die letzte Waschschritt für 2,5 Minuten statt 2 Minuten, wie im Protokoll vorgesehen vorgeschlagen.
- Schließlich ist Elutionspuffer zugegeben und auf dem Filter in der Säule für 1 Minute, gefolgt von Zentrifugation, um die Gesamt-RNA zu eluieren.
- Pipette 1.3ul von jeder der Proben in separaten 0,5 ml Röhrchen zum Ausführen eines Experion HighSens LabChip. Frieren Sie den Rest der Probe bei -80 ° C.
Die Qualitätskontrolle ist sehr wichtig bei der Isolierung von RNA, insbesondere, wenn die Menge gering ist und die benötigte Menge, wie für Microarray-Experimente (15μg), ist groß. Die extrahierten RNA muss daher die Qualitätskontrolle zu verschiedenen Zeitpunkten während des gesamten Prozesses zu unterziehen. Die erste tritt nach der Extraktion. Wir stellen die Gesamt-RNA Integrität mittels grober Prüfung der 18S/28S Gipfel der Elektropherogramme und virtuelle Gel durch Experion HighSens LabChip generiert. Diese Methode ist schnell und bietet zwei Möglichkeiten der Messung auf RNA-Qualität-ein Elektropherogramm und ein virtuelles Gel (Abb. 2) zu überprüfen. Wenn die Qualität der Gesamt-RNA ist relativ gut (Abb.. 2A, B vs C, D), den wir dann mit linear Verstärkung der mRNA, die rund 2% der Gesamt-RNA-Konten vor.
5) Lineare Verstärkung:
Amplifikation von RNA aus Laser-Capture-Gewebe entnommen wird, um eine ausreichende Menge an RNA für nachfolgende Microarray-Hybridisierung und qRT-PCR-Experimente erzeugen notwendig. Um die Möglichkeit von potentiellen verwechselt mit T7-basierte lineare Verstärkung bemerkt zu minimieren, minimiert man die Anzahl der Runden Verstärkung notwendig durch die Maximierung der Menge des Ausgangsmaterials Laser-Capture-Gewebe Materialien.
Unsere vorläufigen Daten (nicht dargestellt) zeigen, dass zwei Runden lineare Verstärkung (RiboAmp HS PLUS Kit) von Gesamt-RNA aus dem Gewebe, das etwa 500 Zellen enthalten extrahiert erzeugen würde etwa 50 Mikrogramm des Arna - ausreichend für die Leistung der beiden Microarray-und qRT-PCR Experimente. Wenn möglich, vermeiden Sie unnötige Übertragung der Probe zwischen 0,2 ml und 0,5 ml Röhrchen mit 0,5 ml Block in den Thermocycler und 0,5 ml Röhrchen im Kit zur Verfügung gestellt.
Auch hier ist das Protokoll, gefolgt das mit dem Kit bei. Eine gekürzte Version ist hier beschrieben.
- Add 1μl der Grundierung versehen, um die RNA-Probe (ca. 11μl) und inkubieren bei 65 ° C für 5 Minuten, durch Kühlen bei 4 ° C folgte für 1 Minute.
- Add ersten Strang cDNA-Komponenten zusammen mit SuperScript III Reverse Transkriptase und Inkubieren bei 42 ° C für 1 Stunde.
- Nach dem zweiten cDNA-Synthese, Reinigung der resultierenden cDNA durch eine Reinigung Spalte zur Verfügung gestellt. Hier empfehlen wir, dass bei der Übertragung der Probe plus Bindungspuffer zur Reinigung Spalte den Probenröhrchen zweimal Zentrifuge - einmal nach der Übertragung der Probe auf die Säule, da bis zu 1μl der Probe bleibt auf den Seiten der Rohre nach dem Transfer.
- Waschen Sie die cDNA mit dem Waschpuffer zur Verfügung gestellt und eluieren die gereinigte cDNA mit dem Elutionspuffer.
- Fügen Sie die in vitro-Transkription Komponenten und inkubieren für 6 Stunden bei 42 ° C.
- Nach einer DNase Schritt, reinigen die daraus resultierenden aRNA mit den Puffern versehen, schließlich eluting es in insgesamt 12μl Elutionspuffer.
Die RNA erfährt eine weitere Runde der lineare Verstärkung (mit separatem Primer - siehe Kit-Protokoll), nach denen mehr Qualitätskontrolle Schritte eingesetzt werden. Ein ul der Probe wird verdünnt auf ca. 250ng/ul der mRNA-Transkript Länge und Konzentration mit dem StdSens LabChip (Experion) zu bestimmen. Traditionelle Affymetrix Microarray-Technologie erfordert die mRNA um mindestens 600 Nukleotide lang sein, um erkannt zu werden. Das Gel und Elektropherogramm von der LabChip erhalten sollte daher zeigen diese minimale mRNA-Transkript Länge (Abb. 3).
Eine weitere Qualitätskontrolle erfolgt über eine NanoDrop Spektralphotometer Analyse, wo ein Verhältnis aus zwei optischen Dichten, dh A260 und A280 bestehen, bestimmt RNA Reinheit bestimmt. Proben mit einer optischen Dichte von rund 2,1 sollte zur Genexpressionsanalyse gekennzeichnet werden, obwohl Verhältnisse von bis zu 2,7 haben gezeigt worden, um vergleichbare Hybridisierung Qualität haben. Die Konzentration sollte auch zwischen 800ng/μl-1μg/μl werden, da unter diesem geführt hat, um den Abbau während der Lagerung RNA (auch bei Temperaturen unter -80 ° C) und hat auch schlechte Microarray-Ergebnissen geführt.
6) Biotin-Kennzeichnung mRNA Proben für Affymetrix Microarray-Analyse:
Die TURBO Biotin Labeling Kit (end-Kennzeichnung) von Molecular Devices verwendet, um die aRNA von amplifizierten Proben erhalten Etikett. Eine verkürzte Version des Protokolls ist hier gegeben.
- Stellen Sie die Lautstärke von 20 ug jeder aRNA Probe 13μl insgesamt indem Nuklease-freiem Wasser oder durch die Konzentration der Probe in einer Vakuumzentrifuge, abhängig von der ursprünglichen Konzentration. Obwohl nur 15μg ist notwendig für die Affymetrix-Chip verwendet, fügen wir 20mg die erste Reaktion, als einige RNA während der Inkubation und Zentrifugation verloren geht.
- Inkubieren Sie die Biotin-Reaktion bei 85 ° C für 30 Minuten, und dann chillen bei 4 ° C.
- Entfernen Sie das überschüssige Biotin-Markierung durch Zentrifugation mit den spezialisierten Spalte mit dem Kit bei. In einigen Fällen, insbesondere mit degradierten mRNA, wie sie aus FFPE (Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettet) erhaltenen Proben, könnte es sein, dass nicht alle mRNA in der einzigen Zentrifugationsschritt eluiert werden. Wir empfehlen dann zwischen 1-5μl zusätzliche Nuklease-freies Wasser hinzufügen, um die Spalte mit einer anschließenden zusätzlichen Zentrifugationsschritt von 1 Minute. Dadurch wird sichergestellt, dass die meisten der markierten Probe eluiert wird.
- Das Endvolumen beträgt 20 &mgr; l, mit einer Konzentration von 1μg/μl. Wenn zusätzliche Nuklease-freiem Wasser aufgenommen, konzentrieren sich die Proben an dasrichtige Volumen mit einer Vakuum-Zentrifuge. Wir empfehlen die Lagerung Konzentration vor Beginn der Hybridisierung über 800ng/μl, wie wir gefunden haben, dass weniger als dies, um den Abbau während der Lagerung und / oder Hybridisierung was zu einer schlechten Microarray-Ergebnissen führen.
aRNA wurde dann hybridisiert und Genexpression profiliert, mit dem Human X3P GeneChip Sondenarray von Affymetrix. Da dieser Chip für mehr abgebaut aRNA entworfen wurde, haben wir es als Vorsichtsmaßnahme, da viele Faktoren, die wir nicht kontrollieren können, die Qualität der postmortalen Gewebe beeinflussen können. Da unser Labor nicht über die geeigneten Einrichtungen für die Hybridisierung wurde der Prozess auf der Partners Genomic Core-Anlage durchgeführt.
Repräsentative Ergebnisse:
1 +2 +3) Tissue Schneiden, Färben von pyramidalen Neuronen und Laser-Mikrodissektion:
Die oben beschriebenen Protokoll sollte in zwei Schlitten mit vier Abschnitten pro Folie führen. Jeder Abschnitt sollte glatt mit minimalen Risse, Brüche und Falten. Mit der richtigen Färbung, wird der Fleck dunkel gebeizt Pyramidenneuronen rund 20 identifizieren - 25 um in der Größe mit einer Pyramidenform und sichtbare apikale Dendriten. 700 Zellen pro Abschnitt / case was zumindest 500PG von Gesamt-RNA - Mit der CapSure HS Kappen bei Macro-Einstellungen und das richtige Einstellen der Laserleistung und Kraft für jeden Abschnitt, sollten Sie etwa 500 erhalten. Etwa 85 bis 100% der Neuronen wird die Kappe (Abb. 1) zu halten.
4) Beziehen RNA aus speziellen neuronalen Populationen:
Wie beschrieben, nach dem Gesamt-RNA isoliert, überprüfen wir die RNA-Qualität durch ein Elektropherogramm und virtuelle Gel über die Bio-Rad Experion. Im Elektropherogramm, sollten Sie zwei getrennte Peaks entsprechend der 18S und 28S ribosomalen RNA-Einheiten. Mit post mortem Gewebe, jedoch ist dies nicht immer der Fall, da das Gewebe abgebaut werden kann aufgrund von Faktoren, vor dem Schneiden. Sie sehen normalerweise eine große Beule zeigt Abbau, mit einer großen Spitze um 18S, und eine kleinere 28S-Peak (Abb. 2A, B). Solange das Elektropherogramm Profilen vergleichbar Proben sind, haben wir diesen Leitfaden gefunden, in mRNA Qualität gut genug, um sowohl RT-PCR und Microarray-Studien (Imbeaud et al., 2005) führen führen.
Wenn es zu viel Erniedrigung - wie durch eine große Fläche unter der Kurve der Elektropherogramm angegeben, oder wenn Gipfeln nicht sichtbar sind (Abb. 2C, D) - die Zellen sollten wieder aus dem Gewebe aufgenommen werden. Wir würden auch empfehlen dabei eine Gewebe-kratzen-Test, wo RNA aus ganzen Fragmente des Abschnitts (nicht nur Zellen) gewonnen wird, vor der Rückeroberung der Zellen zu bestimmen, ob das Gewebe Block selbst abgebaut wird.
5) Lineare Verstärkung:
Um zu testen, die Qualität der mRNA nach zwei Runden der linearen Verstärkung, benutzten wir sowohl die Bio-Rad Experion StdSens LabChip und die NanoDrop Spektralphotometer. Traditionelle Affymetrix Microarray-Technologie erfordert die mRNA um mindestens 600 Nukleotide lang, um erkannt zu werden, die mit diesem Protokoll erhalten wurde. In der Tat waren mRNA Längen in den 1000-Nukleotid-Bereich nachgewiesen werden. Das Elektropherogramm spiegelt auch diese mit großen Gipfeln langsam absteigenden als Funktion der Zeit (Abb. 3A, B).
Die NanoDrop Lesungen zeigten eine A260/A280 Verhältnis Durchschnitt von 2,5 auf Proben, was darauf hinweist lebensfähig mRNA (Tabelle 2).
Unsere Ergebnisse zeigen, dass mit diesem Protokoll, sowohl die Quantität und Qualität der RNA erhalten gut genug, um die Genexpression Unterschiede über die Affymetrix GeneChip menschlichen X3P befragen ist.
6) Biotin-Kennzeichnung mRNA Proben für Affymetrix Microarray-Analyse:
Nach der Hybridisierung der Affymetrix GeneChip menschlichen X3P erreichten wir Anrufe Prozent von durchschnittlich 26,6% (Tabelle 2), was darauf hinweist ausreichende Hybridisierung und Sonde Intensitäten.
Tabelle 1: Zusammenfassung Cohort
| Proben | Gruppe | Sex | Alter | PMI |
| C1 | KONTROLLE | F | 79 | 15,00 |
| C2 | KONTROLLE | M | 22 | 21,47 |
| C4 | KONTROLLE | M | 75 | 20,25 |
| C5 | KONTROLLE | M | 80 | 15,50 |
| C6 | KONTROLLE | F | 58 | 21,08 |
| C8 | KONTROLLE | M | 61 | 17,00 |
| C10 | KONTROLLE | F | 71 | 20,50 |
| C11 | KONTROLLE | F | 12,66 | |
| C12 | KONTROLLE | F | 86 | 6,92 |
| MEAN | 4M/5F | 69,11 | 16,71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6,92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21,40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21,80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22,00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17,97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10,75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17,80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21,83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13,33 |
| MEAN | 4M/5F | 68,11 | 16,90 |
Abkürzungen: F - Buchse, M - Männlich, PMI - post mortem Intervall, schizoph. - Schizophrenie.
Tabelle 2: Zusammenfassung der Ergebnisse darstellen RNA-Konzentration, Qualität und Hybridisierungseffizienz
| Proben | [MRNA] ng / ul | A260/A280 | Probe Intensity | Prozent nennen |
| C1 | 1318,01 | 2,67 | 63 | 19,5 |
| C2 | 2312,93 | 2,37 | 147 | 30,6 |
| C4 | 1811,92 | 2,44 | 69 | 26,6 |
| C5 | 1316,26 | 2,51 | 78 | 34,7 |
| C6 | 1663,24 | 2,39 | 66 | 33,8 |
| C8 | 633,05 | 2,54 | 101 | 15,2 |
| C10 | 1326,4 | 2,47 | 92 | 32,5 |
| C11 | 994,24 | 2,75 | 76 | 22,4 |
| C12 | 817,23 | 2,7 | 56 | 15,2 |
| S1 | 2560,88 | 2,47 | 78 | 25,0 |
| S2 | 2169,61 | 2,43 | 76 | 26,5 |
| S3 | 2067,32 | 2,52 | 87 | 22,1 |
| S4 | 1563,89 | 2,75 | 82 | 28,1 |
| S5 | 2071,44 | 2,44 | 88 | 28,2 |
| S6 | 2532,59 | 2,34 | 72 | 30,7 |
| S8 | 2189,22 | 2,5 | 62 | 31,8 |
| S11 | 1669,89 | 2,47 | 41 | 27,3 |
| S12 | 1739,35 | 2,47 | 42 | 28,0 |
| MEAN | 1708,75 | 2,51 | 76,44 | 26,57 |
Abbildung 1:. Zusammenfassung der Laser-Mikrodissektion Prozess A) Pyramidenneuronen sind morphologisch identifiziert. B) Nach der Laser durch die thermoplastische Folie gepulsten hat, die Zellen, die Kappe halten und sind daher nicht mehr auf der Folie, so dass das umliegende Gewebe dahinter. C) Mikroskopische Aufnahme eines homogenen Zellpopulation auf die Einhaltung CapSure Cap nach Laser-Erfassung.
Abbildung 2:. Gesamt-RNA Qualitätskontrolle A + B) für gute Qualität der Gesamt-RNA nach der Isolation, während C + D) zeigt, was Gesamt-RNA sollte nicht wie nach der Isolation zu suchen. A) Ein Elektropherogramm mit klaren 18/28S Peaks mit der virtuellen Gel in (B). C) ein Elektropherogramm zeigt eine große Fläche unter der Kurve und keine 18S/28S Gipfel zeigt RNA-Abbaus. Dies ist auch in der virtuellen Gel (D) gezeigt.
Abbildung 3:. MRNA Qualitätskontrolle A + B) Elektropherogramm (A) und virtuellen Gel (B), welche die mRNA-Transkript Kielth (spread), die für Microarray-Studien, dh Verlängerung letzten 600 Nukleotide (nt). C + D) Elektropherogramm (C) und virtuellen Gel (D) zeigt, was eine unzureichende mRNA Verbreitung aussehen würde, wie die mRNA-Transkript Länge nicht erstreckt Vergangenheit 200nt.
Discussion
Hier versuchen wir, ein Protokoll anzufertigen, um homogene Zellpopulationen aus heterogenen postmortalen Hirngewebe mit dem Arcturus XT-System und verwandte RNA Extraktion Kits zu extrahieren. Wie oben dargelegt, haben wir einige Änderungen an dem ursprünglichen Protokolle, die von dem Unternehmen zur Verfügung gestellt hat, um RNA-Integrität zu maximieren. Die erfolgreiche Erfassung der einzelnen Zellen hängt einzig und allein auf die Optimierung der Schritte vor der Aufnahme um ein Höchstmaß an Zellen mit guter RNA zu erreichen. Diese Schritte umfassen die verschiedenen Parameter mit Gewebe Schneiden und Färben verbunden. Kurz gesagt, in Bezug auf Gewebe Vorbereitung dazu gehören: 1) Verringerung der Temperaturgradienten beim Schneiden, 2) nur Platzierung 2 Sektionen pro Objektträger, 3) die Durchführung aller Dehydration Schritte auf Eis, 4) Zugabe von RNase Inhibitor, um den Fleck, 5) erhöht die Dehydratisierung Dauer in den letzten 100% Ethanol bis 3 Minuten.
Im Hinblick auf die Erfassung, fühlen wir, dass die Kombination von CapSure HS Kappen, mit der Software auf Makro-Einstellung, sollte für optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Ein Feuchte-kontrollierten Umgebung ist entscheidend für die Erfassung von einzelnen Zellen, wie hohe Luftfeuchtigkeit drastisch reduziert Gewebe "lift". Hohe Temperaturen können auch einen negativen Effekt auf die RNA-Qualität.
Während der RNA-Isolierung Protokoll mit dem PicoPure Kit gibt es zwei Waschschritte. Es ist wichtig zu überprüfen, ob alle Waschpuffer vor der Übertragung auf ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen für die RNA-Elution entfernt ist, wie jede Gegenwart des Puffers in die endgültige Probe wird in weniger Ausgangs-RNA zur Verstärkung führen. Um dies zu gewährleisten, Zentrifuge wir die letzte Waschschritt für 2,5 Minuten statt 2 Minuten, wie im Protokoll vorgesehen vorgeschlagen.
Zum größten Teil wurde die lineare Verstärkung Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers. Allerdings sollten zwei wichtige Punkte berücksichtigt werden, wenn dieses Protokoll verwenden: 1) versuchen, um den Verlust der RNA über mehr als die Übertragung von Proben Grenze zwischen Rohren, indem nur die 0,5 ml Röhrchen in Verbindung mit einem 0,5 ml-Block in den Thermocycler zur Verfügung gestellt und 2) bei der Übertragung der Probe auf die Reinigung Spalte für die Reinigung von cDNA, achten Sie darauf, Spin-down der Probenröhrchen nach der ersten Übertragung. Dies wird in einer zusätzlichen 1-2UL der Probe auf die Reinigung Spalte hinzuzufügen und kann daher cDNA Besserung steigt führen.
Bei der Nutzung der TURBO End-Labeling Kit für Biotin-Markierung von Ihrer begrenzten aRNA Proben, empfehlen wir Ihnen das Hinzufügen eines zusätzlichen wenigen ul ist von Wasser vor dem Zentrifugationsschritt zur Erhöhung der markierten RNA aus der Säule entnommen Ertrag. Eine zusätzliche Minute Zentrifugation wird auch in dieser Hinsicht helfen, besonders wenn Sie mit dem abgebauten Gewebe, wie FFPE Gewebe arbeiten.
Wir sind zuversichtlich, dass dieses Protokoll wird dem Benutzer zu ermöglichen kleinen homogenen Strukturen wie einzelne Zellpopulationen in heterogenen postmortalen Hirngewebe zu isolieren. Dies reduziert Verwässerungseffekte von umgebenden Strukturen und anderen Zelltypen in den verschiedenen Schichten innerhalb des Gehirns lokalisiert ist, was die Ergebnisse auf die spezifischen Zelltypen untersucht ausgerichtet. Da die Qualität der resultierenden RNA ist gut genug für Microarray-Studien, können wir beginnen, spezifische molekulare Signaturen von spezifischen Zellpopulationen in Krankheit betroffenen Staaten lokalisieren.
Disclosures
Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von Life Technologies gesponsert.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für Molecular Devices Analytical Technologien / Arcturus für die großzügige Spende von Reagenzien für die Studie verwendet. Wir danken auch der Harvard Tissue Resource Center für die Bereitstellung von postmortalen menschlichen Hirngewebe Finanzierung:. RO1MH76060 und P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
