Summary
We beschrijven een proces met behulp van laser-capture microdissectie te isoleren en RNA uittreksel uit een homogene celpopulatie, piramidale neuronen, in laag III van de superieure temporale gyrus in postmortale de menselijke hersenen. We vervolgens lineair versterken (T7-based) mRNA, en hybridiseren het monster op de Affymetrix menselijke X3P microarray.
Abstract
We stelden voor om de grijze stof vermindering van de superieure temporale gyrus gezien bij schizofrenie patiënten te onderzoeken, ondervragen door de genexpressie profielen van piramidale neuronen in laag III. Het is bekend dat de cerebrale cortex is een bijzonder heterogene structuur, bestaande uit diverse regio's, lagen en celtypen, die elk gekenmerkt wordt door verschillende cellulaire en moleculaire samenstelling en dus differentiële genexpressie profielen. Te omzeilen van de verstorende effecten van weefsel heterogeniteit, gebruikten we laser-capture microdissectie (LCM) om onze specifieke cel-type dwz piramidale neuronen te isoleren.
Ongeveer 500 piramidale neuronen gekleurd met de Histogene kleuroplossing werden gevangen met behulp van de Arcturus XT LCM-systeem. RNA werd vervolgens geïsoleerd van de gevangen cellen en onderging twee rondes van T7-techniek gebaseerde lineaire amplificatie met behulp van Arcturus / Molecular Devices kits. De Experion LabChip (Bio-Rad) gel en electropherogram aangegeven van goede kwaliteit een (m) RNA, met een transcript lengte tot voorbij 600nt die nodig zijn voor microarrays. Het bedrag van het verkregen mRNA gemiddeld 51μg, met een aanvaardbare gemiddelde zuiverheid monster zoals aangegeven door de A260/280 verhouding van 2,5. Genexpressie werd geprofileerd met behulp van de Human X3P GeneChip probe array van Affymetrix.
Protocol
1) weefsel snijden:
We kregen de nodige weefsel (controle n = 9, schizofrenie n = 9) uit de Harvard Brain Tissue Resource Center, gematcht voor leeftijd, geslacht en postmortem-interval (PMI) (tabel 1). Vloeibare stikstof damp blokken waren ongeveer 3 mm dik zijn afkomstig uit regio's Brodmann 42 (gyrus temporalis superior).
Voordat u begint met kleuring van piramidale neuronen, moeten voorwaarden worden geoptimaliseerd om een optimale weefsel "lift" en de hoge RNA kwaliteit te verkrijgen. Weefsel "lift" beschrijft het proces tijdens de laser-capture microdissectie, waar de neuronen gemarkeerd voor het vastleggen zich te houden aan de dop en worden gescheiden, terwijl de overblijvende weefsel wordt achtergelaten.
Optimalisatie:
- Met het oog op RNase activiteit, die RNA kwaliteit compromissen te verminderen, te behandelen alle oppervlakken, inclusief het werkgebied, snijden mes en dia's met een RNase decontaminatie oplossing, zoals RNase Zap, in aanvulling op afvegen neer met 100% ethanol.
- Gedeelte van de weefsel met de cryostaat ingesteld op -17 ° C. Dit vermindert de temperatuurgradiënt tussen kamertemperatuur (dia's), de cryostaat, en het droge ijs (zie gehele proces hieronder). Als de temperatuur lager is dan -20 ° C, de weefselcoupes de neiging om versnipperen, waardoor ze onbruikbaar worden. Hoger en de temperatuur gradiënt toe, wat RNA integriteit in gevaar kunnen brengen.
- De secties moet worden 8μm dik, zoals dikkere secties uiteindelijk zal tissue "lift" compromis. Deze dikte maakt het ook mogelijk correcte identificatie van de piramidale neuronen voor vast te leggen.
- Gebruik gewoon ongeladen glazen objectglaasjes (bijv. Histogene LCM dia's), aangezien deze niet interfereren met tissue "lift" tijdens de laser-capture proces. Membraan dia's kunnen ook worden gebruikt, maar deze zijn meer geschikt voor het isoleren van grote weefsel structuren, zoals het membraan heeft de neiging om een beetje lift tijdens de laser-capture proces, waardoor de infrarood (IR) laser spot grootte en de afnemende cel specificiteit.
- Mount twee delen per glasplaatje, als meer dan twee secties per dia kon RNA kwaliteit compromis te wijten aan de constante variatie in temperatuur tijdens het snijden proces.
- Na het snijden, onmiddellijk plaatsen van de dia's in een micro-slide doos op droog ijs om RNA integriteit te bewaren. Schuif dozen met de hersenen secties worden vervolgens opgeslagen bij -80 ° C tot verwerkt.
We hebben eerder vastgesteld dat voor de piramidale neuronen, 500 cellen per geval toereikend zijn om voldoende RNA te verwerven voor microarray hybridisatie. Ongeveer vier secties nodig zijn per geval, voornamelijk als gevolg van snijden en vlekken artefacten.
2) kleuring van de piramidale neuronen:
Identificatie van de piramidale neuronen is bereikt met de Histogene snelle kleuroplossing en kit, omdat het ons toelaat om deze neuronen te visualiseren, zonder dat langdurige blootstelling aan waterige oplossingen, waardoor het behoud van RNA.
- Bereid je voor op de kleuring procedure door het toevoegen van 1μl RNase inhibitor per 100μl van kleuroplossing (bijv. Promega) om het RNase activiteit te beperken. Vier secties (2 dia's), vereisen 4μl van RNase inhibitor toegevoegd aan 400μl van de Histogene kleuroplossing in een 1,5 ml microcentrifugebuis (bewaard op ijs). Voor elke sectie, gebruiken we 97μl van deze oplossing, die ons een adequate vlek te identificeren piramidale neuronen.
- Bereid uitdroging serie en xyleen: aliquot 25ml van de juiste rietsuikeralcohol in de kleuring potten die bij de Histogene kit, dat wil zeggen 2x75%, 95%, 100% en 2 potten van RNase-vrij water. Plaats alle potten in een ijsemmer, met uitzondering van een 75% pot, die u plaats in de -20 ° C vriezer. Onder een zuurkast, voeg moleculaire zeven in de xyleen pot om het overtollige water, dat weefsel "lift" in gevaar kunnen brengen te verwijderen.
- Schakel het waterbad (of warmte blok) met de temperatuur ingesteld op 42 ° C en plaats een 50 ml Falcon buis wordt ondersteund door een rek in het waterbad.
- Verwijder de twee dia's van -80 ° C en ontdooien ze op een KimWipe gedurende ongeveer 30 seconden, of gewoon tot aan de hoeken van de dia's beginnen te ontdooien.
- Kort vast de dia's in de 75% ethanol gedurende 30 seconden in de -20 ° C vriezer. Overdracht van de dia's tussen kleuring potten met behulp van RNase-zapped een tang om besmetting te verminderen.
- Na een 30 seconden wassen nuclease-vrij water, kunnen secties worden aangegeven met een PAP barrière pen om het concentraat voor oplossing voor de sectie, maar met de gewone glazen schuif dit niet absoluut noodzakelijk is.
- Vlekken op de vier secties met de Histogene kleuroplossing voor 20 seconden, met 97μl van de vlek / RNase-remmer per sectie. Vervolgens drogen de secties in de vooraf bereide rietsuikeralcohol op ijs, gedurende 30 seconden per stap. De laatste 100% ethanol stap moet worden uitgebreid tot 3 minuten, Om voldoende uitdroging voor een adequate weefsel "lift" te bereiken en vast te leggen op de LCM caps.
- Dompel de dia's in xyleen gedurende 5 minuten en de lucht drogen in een zuurkast-kap voor nog 5 minuten voorafgaand aan de vast te leggen.
De kleuring stappen moeten alleen worden uitgevoerd als laser-capturing onmiddellijk daarna. Alle oplossingen moet worden veranderd om de 4-6 dia's om verontreiniging te voorkomen en om een goede uitdroging te garanderen.
3) Single cell laser-capture microdissectie:
Na het kleuren, zijn piramidale neuronen van laag III verwijderd met behulp van laser-capture microdissectie, met het Arcturus XT systeem en software. Kortom, het systeem werkt door pulserende een instelbare kracht van IR-laser door middel van een thermoplastische film gelegen aan de voet van een kap, wat resulteert in de uitbreiding / uitzetting van de film direct op de cellen van belang. Wanneer de kap wordt opgetild uit het weefsel, de cellen blijven gevangen / gevangen op de dop. Een picturale samenvatting wordt gegeven in Figuur 1.
Voordat u begint met deze procedure, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen de twee soorten caps leverbaar met dit systeem. Terwijl de Macro CapSure dop wordt meestal gebruikt voor het vastleggen van grote weefsels zijn, worden de CapSure GS-caps ontworpen om kleine aantallen van de individuele cellen te vangen en daarom deze doppen hebben een kleinere oppervlakte is aangewezen voor vast te leggen. De HS caps hebben ook rails dat de kap te voorkomen dat in direct contact met het weefsel gedeelte, terwijl de Macro cap niet. Deze rails verminderen het effect van weefsel vouwen die invloed kunnen hebben of induceren variabiliteit van spot grootte (van de laser puls) als de Macro kap ligt direct aan gevouwen, oneffen weefsel. Voor onze procedure, gebruikten we de GS-caps om te profiteren van hun vermogen om het effect van weefsel vouwen verminderen, maar de Macro dop instellingen bewaard op de software om de vastgelegde gebied te maximaliseren als we het vastleggen van een groot aantal cellen.
- Laad de dia's en doppen op de Arcturus XT apparaat. Gebruik de CapSure GS caps, maar houd het programma-instellingen op Macro. Klik op het vakje "Load met overzicht" om een overzicht foto van elke dia te verkrijgen.
- Pas de helderheid / focus op 2x vergroting, om te bepalen welke sectie optimaal zou zijn voor laser-capture. Vermijd het weefsel secties met veel vouwen, maar eerder kiezen voor secties die intact zijn, glad, en bevlekt goed, vooral bij de regio van belang dat wil zeggen laag III.
- We hebben plaats dan een kapje over de algemene ruimte waar we het vastleggen, en zorg ervoor dat laag III op te nemen. Nog in de 2x vergroting, zorg ervoor dat de dop rails niet rusten op een plooien, omdat dit de dop kantelen.
- Vervolgens bevestigen wij de locatie van de IR-laser ter plekke handmatig op de 40x vergroting. Als de plek (rode balk) niet correleren met het blauwe kruis, kan dit worden aangepast door met de rechtermuisknop te klikken op de plek en het selecteren van "gelegen IR spot".
- Bij 40x, kunnen we beginnen met piramidale neuronen te identificeren op basis van de volgende criteria (1) cellen die zijn piramidaal van vorm en (2) het proximale deel van de apicale en / of basale dendrieten identificeerbaar zijn (Fig. 1A).
We hebben nu pas de kracht en de duur van de laserpuls om de piramidale neuron vast te leggen. Dit is vooral belangrijk, omdat het bepaalt de specificiteit van de cel gevangen in aanvulling op het aantal gevangen cellen. Als de puls te zwak is niet alle geïdentificeerde neuronen zullen worden vastgelegd, terwijl indien de pols te sterk zou kunnen vangen omliggende weefsel / cellen anders dan de neuron alleen. In het algemeen, met de weefsels en cellen specificaties hier toegepast, de laser sterkte (70mW) en duur (16msec) resulteren in een puntgrootte van 25μm, ongeveer in lijn met piramidale neuron grootte (Fig. 1B). Echter, deze instellingen zijn afgestemd op elke sectie om ongeveer dezelfde plek omvang per geval te verkrijgen. Als "lift" gedrang komt, kan men altijd het aantal gevangen cellen om de hoeveelheid RNA die van elk geval vergelijkbaar te houden. Echter, moet u uw capture tijd bij te houden inclusief vlekken onder 1,5 uur, als langer dan dit kan RNA kwaliteit compromis.
- Eerst opslaan van de positie van de dop door te klikken op het plus-teken op de positie-functie. Op deze manier, als om welke reden moeten we de dop verwijderen en vervolgens nodig om het weer op dezelfde locatie, zal de dop altijd terug naar precies dezelfde plek die je de puntgrootte voor aangepast.
- Voer deze waarden in de schakelkast: 70 aan de macht en 16 in de duur. Unclick de "auto te verplaatsen stage" optie, en zorg ervoor dat de juiste maat symbool correleert met het symbool op het paneel aan de rechterkant.
- Selecteer de cirkel optie (onderaan rechts) om een neuron dat u wilt vastleggen test te selecteren, en activeer de laser door te klikken opop de "test IR spot".
- De plek van de laser moet eerst beschikken over een heldere donkere ring rond het object gevangen. Als deze ring te licht is, is de cel niet vastgelegd. Als er een donkere vlek in het midden van de donkere ring, dan is de laser kracht / duur is te groot, en het zou een negatief effect hebben op de RNA aanwezig is in de vastgelegde cel. Zorg ervoor dat de ring is groot genoeg om de cel te omvatten, maar klein genoeg dat het niet ongewenst weefsel of andere cellen bevatten.
- Herhaal dit proces op verschillende delen van het weefsel in de laag die u wilt vastleggen, om te controleren dat de puntgrootte niet verschilt afhankelijk van de locatie. Dienovereenkomstig aan te passen.
- Nadat de laser spot is aangepast, blijven piramidale neuronen voor het vastleggen identificeren. We identificeren ongeveer 500 cellen per monster, wat resulteert in ongeveer 500pg van totaal RNA per monster. We hebben ook meestal alleen gebruik maken van een gedeelte in om de hoeveelheid te vangen te verminderen, omdat de dop moet aangepast worden voor elke sectie. Als je eenmaal hebt geïdentificeerd van alle cellen die u nodig hebt, drukt u op de laser-capture knop en al je cellen automatisch worden vastgelegd op de kap (Fig. 1C).
- Als alle cellen zijn vastgelegd, verplaatst u de dop om een ander deel van de dia die niet bevat een sectie. Ga terug naar de plaats waar de cellen werden gevangen genomen en ervoor te zorgen dat ten minste 90% van de neuronen werden verwijderd. Zo niet, probeer dan niet dezelfde cellen heroveren, maar zoek het gebied waar de meeste van de cellen werden gevangen genomen, en vast te leggen meer cellen in hetzelfde gebied. Verplaats de dop om de QC station.
- Plaats de dop in de 0,5 ml microcentrifugebuis van Applied Biosystems (cat. # N8010611) met 50 ml extractiebuffer (PicoPure RNA isolatie kit). De kap is ontworpen om perfect te passen in deze specifieke tube naar buffer te voorkomen lekken.
- Draai de montage ondersteboven, zorg ervoor dat extractiebuffer de gehele kap bedekt en plaats deze op de bodem van de 50 ml Falcon buis al aanwezig in het waterbad ingesteld op 42 ° C. De neuronen zijn gedurende 30 minuten om het weefsel te verwijderen van het deksel.
- Daarna, centrifuge de tube en het dopje assemblage gedurende 2 minuten bij 800 g. Verwijder de dop en bewaar de rest van celextract bij -80 ° C tot RNA-extractie. Als extra voorzorgsmaatregel, kunt u opnieuw de dop op de QC-station op de laser-capturing apparatuur om ervoor te zorgen dat alle neuronen zijn verwijderd uit de dop zelf.
4) Het verkrijgen van RNA van specifieke neuronale populaties:
Men kan direct vanuit het vastleggen op isolatie, of dooi het monster is opgeslagen in de -80 ° C vriezer. In ons experiment hebben we eerst alle nodige monsters en bewaard ze bij -80 ° C verzameld alvorens over te gaan tot isolatie RNA.
RNA-isolatie wordt uitgevoerd met behulp van de PicoPure Isolation Kit, die is ontworpen om kleine aantallen cellen van LCM monsters te isoleren en low-overvloed mRNA te behouden. Over het algemeen, volgen we het protocol dat wordt meegeleverd met de kit. Hieronder geven we een eenvoudige beschrijving van het proces.
- Na het ontdooien, voeg 70% ethanol (geleverd bij de kit) en gecentrifugeerd op een pre-geconditioneerde zuiveringskolom om de RNA binden aan de kolom te filteren.
- Na het wassen, behandelen de RNA met DNase, om volledige verwijdering van DNA ervoor te zorgen dat het risico van DNA interferentie te elimineren. Deze stap is vooral belangrijk in downstream-toepassingen zoals real-time qRT-PCR.
- Naar aanleiding van het DNA te verteren, is er nog een wasstap. Controleer of er geen wasbuffer blijft in de kolom alvorens naar een ander microcentrifugebuis, zoals elke aanwezigheid van de buffer in uw uiteindelijke steekproef zal resulteren in minder vanaf RNA voor versterking. Om dit te waarborgen, hebben we centrifuge de laatste wasstap voor 2,5 minuten in plaats van 2 minuten zoals voorgesteld in de daarvoor bestemde protocol.
- Tenslotte wordt elutie buffer toegevoegd en geïncubeerd op het filter in de kolom gedurende 1 minuut, gevolgd door centrifugeren, om het totale RNA elueren.
- Pipetteer 1.3ul van elk van de monsters in afzonderlijke 0,5 ml buizen aan een Experion HighSens LabChip lopen. Bevriezing van de rest van het monster bij -80 ° C.
Kwaliteitscontrole is heel belangrijk bij het isoleren van RNA, vooral wanneer de hoeveelheid klein is en het benodigde bedrag, zoals voor microarray experimenten (15μg), is groot. De afgezogen RNA daarom moet ondergaan kwaliteitscontrole op verschillende tijdstippen gedurende het gehele proces. De eerste komt na extractie. We stellen het totale RNA integriteit via bruto onderzoek van de 18S/28S toppen van de electropherograms en virtuele gel gegenereerd door Experion HighSens LabChip. Deze methode is snel en biedt twee manieren van metingen aan de kwaliteit-RNA een electropherogram en een virtuele gel (afb. 2) te controleren. Als de kwaliteit van het totale RNA is relatief goed (Fig. 2A, B vs C, D), we dan verder met lineair versterken van het mRNA, dat goed is voor ongeveer 2% van het totaal RNA.
5) Lineaire versterking:
Amplificatie van RNA geëxtraheerd uit laser-gevangen weefsel is noodzakelijk om een voldoende hoeveelheid RNA voor latere microarray hybridisatie en qRT-PCR experimenten te produceren. Met het oog op de mogelijkheid van potentiële verwart heeft met T7-gebaseerde lineaire versterking te minimaliseren, hebben we minimaal het aantal ronden van de versterking nodig door het maximaliseren van het bedrag van de start laser-gevangen weefsel materialen.
Onze voorlopige gegevens (niet getoond) suggereren dat twee rondes van de lineaire versterking (RiboAmp GS PLUS kit) van de totale RNA geëxtraheerd uit weefsel dat ongeveer 500 cellen bevatten, zou produceren ongeveer 50 microgram van ARNA - voldoende voor de uitvoering van zowel de microarray en qRT-PCR experimenten. Indien mogelijk, vermijd onnodige overdracht van het monster tussen de 0,2 ml en 0,5 ml buizen met behulp van 0,5 ml blok in de thermal cycler en de 0,5 ml buisjes die in kit.
Nogmaals, volgde het protocol is de een voorzien van de kit. Een verkorte versie is hier beschreven.
- Voeg 1μl van de primer aan de totale RNA monster (ca. 11μl) en incubeer bij 65 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door koeling bij 4 ° C gedurende 1 minuut.
- Samen te voegen eerste streng cDNA componenten met SuperScript III reverse transcriptase en incubeer bij 42 ° C gedurende 1 uur.
- Na de tweede streng cDNA-synthese, zuiveren de resulterende cDNA door middel van een de reiniging kolom. Hier raden we aan dat bij het overbrengen van de steekproef plus binding buffer naar de zuivering kolom, de monsterbuizen twee keer centrifuge - een keer na de overdracht van het monster op de kolom, zoals tot 1μl van het monster blijft op de zijkanten van de buizen na de transfer.
- Was de cDNA met de meegeleverde wassen buffers en elueer het gezuiverde cDNA met de elutie buffer.
- Voeg de in vitro transcriptie componenten en incubeer gedurende 6 uur bij 42 ° C.
- Na een DNase stap, zuiveren de resulterende ARNA met de meegeleverde buffers, uiteindelijk elueren in een totaal van 12μl van elutie buffer.
Het RNA ondergaat een nieuwe ronde van lineaire versterking (met aparte primers - zie kit protocol), waarna meer kwaliteitscontrole stappen worden gebruikt. Een ul van het monster wordt verdund tot ongeveer 250ng/ul aan het mRNA transcript lengte en concentratie met de StdSens LabChip (Experion) te bepalen. Traditionele Affymetrix microarray technologie vereist het mRNA ten minste 600 nucleotiden in lengte om te worden gedetecteerd. De gel en electropherogram verkregen uit de LabChip moet daarom verbeelden deze minimale mRNA transcript lengte (afb. 3).
Een extra kwaliteitscontrole wordt bepaald via een NanoDrop spectrofotometer analyse, waarbij een verhouding die bestaat uit twee optische dichtheden, dat wil zeggen A260 en A280, bepaalt RNA zuiverheid. Monsters met een optische dichtheid ongeveer 2,1 dient te worden gelabeld voor genexpressie analyse, hoewel ratio tot 2,7 is aangetoond dat vergelijkbaar is hybridisatie kwaliteit. De concentratie moet ook tussen de 800ng/μl-1μg/μl, zoals lager dan dit heeft geleid tot een degradatie RNA tijdens de opslag (ook bij temperaturen onder -80 ° C) en heeft ook geleid tot een slechte microarray resultaten.
6) biotine-etikettering van mRNA monsters voor Affymetrix microarray analyse:
De TURBO Biotine labeling kit (eind-labeling) van Molecular Devices wordt gebruikt om de ARNA verkregen uit versterkte stalen label. Een verkorte versie van het protocol wordt hier gegeven.
- Pas het volume van 20 ug van elk ARNA monster 13μl totaal door het toevoegen van nuclease-vrij water of door zich te concentreren het monster in een vacuüm centrifuge, afhankelijk van de beginconcentratie. Hoewel slechts 15μg nodig is voor de gebruikte chip Affymetrix, voegen we 20 microgram aan de eerste reactie, zoals sommige RNA is verloren tijdens incubatie en centrifugeren.
- Incubeer de biotine reactie bij 85 ° C gedurende 30 minuten, en daarna chillen bij 4 ° C.
- Verwijder het overtollige biotine label via centrifugatie met de gespecialiseerde kolom die bij de kit. In sommige gevallen, vooral bij gedegradeerde mRNA zoals die verkregen uit FFPE (formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde) monsters, kan het zijn dat niet alle mRNA wordt geëlueerd in de interne centrifugatie stap. Wij raden toe te voegen tussen de 1-5μl extra nuclease-vrij water aan de kolom met een volgende extra centrifugeren stap van 1 minuut. Dit zorgt ervoor dat de meeste van de gelabelde monster wordt geëlueerd.
- Het uiteindelijke volume is 20μl, met een concentratie van 1μg/μl. Als extra nuclease-vrij water werd toegevoegd, concentreren de monsters naar hetjuiste volume met een stofzuiger centrifuge. Wij raden u aan de opslag concentratie vóór het begin van hybridisatie meer dan 800ng/μl, zoals we hebben vastgesteld dat minder dan dit zal leiden tot een achteruitgang tijdens de opslag en / of hybridisatie resulteert in een slechte microarray resultaten.
ARNA werd vervolgens gehybridiseerd en gen-expressie profiel, het gebruik van de Human X3P GeneChip probe array van Affymetrix. Omdat deze chip is ontworpen voor meer gedegradeerd Arna, gebruikten we het als een voorzorgsmaatregel, zo veel factoren die we niet kunnen controleren kan de kwaliteit van postmortale weefsel beïnvloeden. Aangezien onze lab niet de adequate voorzieningen voor hybridisatie, werd het proces uitgevoerd in de Partners Genomic Core faciliteit.
Representatieve resultaten:
1 +2 +3) Tissue snijden, kleuring van piramidale neuronen en laser-capture microdissectie:
Het protocol hierboven beschreven zou moeten leiden tot twee dia's met vier secties per slide. Elke sectie moet glad zijn met een minimale scheuren, barsten en vouwen. Met de juiste kleuren, zal de vlek te identificeren donker gebeitst piramidale neuronen rond de 20 - 25μm in grootte met een piramidale vorm en zichtbaar apicale dendrieten. Met de CapSure GS-caps op macro-instellingen, en de juiste afstelling van de laser macht en kracht voor elke sectie, moet u het verkrijgen rond 500 tot 700 cellen per sectie / case resulterend in ten minste 500pg totaal RNA. Ongeveer 85 - 100% van de neuronen zal houden aan de dop (fig. 1).
4) Het verkrijgen van RNA van specifieke neuronale populaties:
Zoals beschreven, na het totaal RNA isolatie, controleren we de RNA-kwaliteit door middel van een electropherogram en virtuele gel via de Bio-Rad Experion. In de electropherogram, ziet u twee verschillende pieken die overeenkomen met de 18S en 28S ribosomaal RNA-eenheden. Met de post-mortem weefsel, dit is echter niet altijd het geval, omdat het weefsel kan worden afgebroken als gevolg van factoren voorafgaand aan snijden. Je zal normaal gesproken ziet een grote bult met vermelding van degradatie, met een grote piek rond 18S, 28S en een kleinere piek (Fig. 2A, B). Zolang de electropherogram profielen zijn vergelijkbaar tussen samples, hebben we vonden deze richtlijn te resulteren in mRNA kwaliteit goed genoeg is om zowel de RT-PCR en microarray studies (Imbeaud et al., 2005). Uit te voeren.
Als er te veel afbraak - zoals aangegeven door een groot gebied onder de curve van de electropherogram, of indien pieken niet zichtbaar zijn (Fig. 2C, D) - de cellen moeten opnieuw worden afgenomen uit het weefsel. We zouden ook aan het doen van een tissue-schrapen-test, waarbij RNA wordt gewonnen uit hele fragmenten van de sectie (niet alleen cellen), voordat heroveren de cellen om te bepalen of het weefsel blok zelf gedegradeerd is.
5) Lineaire versterking:
Voor het testen van de kwaliteit van het mRNA na twee rondes van lineaire versterking, hebben we gebruik gemaakt van zowel de Bio-Rad Experion StdSens LabChip en de NanoDrop spectrofotometer. Traditionele Affymetrix microarray technologie vereist het mRNA ten minste 600 nucleotiden in lengte om te kunnen worden opgespoord, die werd verkregen met dit protocol. In feite werden mRNA lengte ontdekt in de 1000-nucleotide bereik. De electropherogram weerspiegelt ook dit met grote pieken langzaam afdalen als een functie van de tijd (Fig. 3A, B).
De NanoDrop lezingen aangegeven een A260/A280 verhouding gemiddelde van 2,5 over monsters, wat aangeeft levensvatbaar mRNA (tabel 2).
Onze resultaten geven aan dat met dit protocol, zowel de kwantiteit als de kwaliteit van RNA verkregen is goed genoeg om verschillen in genexpressie via de Affymetrix menselijke X3P GeneChip ondervragen.
6) biotine-etikettering van mRNA monsters voor Affymetrix microarray analyse:
Na hybridisatie aan de Affymetrix menselijke X3P GeneChip, behaalden we procent noemt van een gemiddelde van 26,6% (tabel 2), wat aangeeft voldoende hybridisatie en probe intensiteiten.
Tabel 1: Cohort samenvatting
| Monsters | Groep | Seks | Leeftijd | PMI |
| C1 | CONTROL | F | 79 | 15,00 |
| C2 | CONTROL | M | 22 | 21,47 |
| C4 | CONTROL | M | 75 | 20,25 |
| C5 | CONTROL | M | 80 | 15,50 |
| C6 | CONTROL | F | 58 | 21,08 |
| C8 | CONTROL | M | 61 | 17,00 |
| C10 | CONTROL | F | 71 | 20,50 |
| C11 | CONTROL | F | 12,66 | |
| C12 | CONTROL | F | 86 | 6.92 |
| MEAN | 4M/5F | 69,11 | 16,71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21,40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21,80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22,00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17,97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10,75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17,80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21,83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13,33 |
| MEAN | 4M/5F | 68,11 | 16,90 |
Afkortingen: F - vrouw, M - Man, PMI - postmortem interval, schizoph. - Schizofrenie.
Tabel 2: Samenvatting van de resultaten beeltenis van RNA-concentratie, de kwaliteit en de hybridisatie efficiëntie
| Monsters | [MRNA] ng / ul | A260/A280 | Probe Intensity | Percentage oproepen |
| C1 | 1.318,01 | 2.67 | 63 | 19,5 |
| C2 | 2.312,93 | 2.37 | 147 | 30,6 |
| C4 | 1.811,92 | 2.44 | 69 | 26,6 |
| C5 | 1.316,26 | 2.51 | 78 | 34,7 |
| C6 | 1.663,24 | 2.39 | 66 | 33,8 |
| C8 | 633,05 | 2.54 | 101 | 15,2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32,5 |
| C11 | 994,24 | 2.75 | 76 | 22,4 |
| C12 | 817,23 | 2.7 | 56 | 15,2 |
| S1 | 2.560,88 | 2.47 | 78 | 25,0 |
| S2 | 2.169,61 | 2.43 | 76 | 26,5 |
| S3 | 2.067,32 | 2.52 | 87 | 22,1 |
| S4 | 1.563,89 | 2.75 | 82 | 28,1 |
| S5 | 2.071,44 | 2.44 | 88 | 28,2 |
| S6 | 2.532,59 | 2.34 | 72 | 30,7 |
| S8 | 2.189,22 | 2.5 | 62 | 31,8 |
| S11 | 1.669,89 | 2.47 | 41 | 27,3 |
| S12 | 1.739,35 | 2.47 | 42 | 28,0 |
| MEAN | 1.708,75 | 2.51 | 76,44 | 26,57 |
Figuur 1:. Samenvatting van de laser-capture microdissectie proces A) piramidale neuronen zijn morfologisch geïdentificeerd. B) Na de laser heeft gepulste door de thermoplastische film, de cellen zich te houden aan de dop en zijn dus niet meer op de dia, waardoor het omringende weefsel achter. C) microfoto van een homogene celpopulatie vasthouden op de CapSure Cap na de laser vastleggen.
Figuur 2:. Totaal RNA kwaliteitscontrole A + B) Vertegenwoordigt een goede kwaliteit van totaal RNA na isolatie, terwijl de C + D) illustreert wat totaal RNA niet uit moet zien na isolatie. A) Een electropherogram met duidelijke 18/28S pieken die overeenkomen met de virtuele gel in (B). C) Een electropherogram toont een groot gebied onder de curve en geen 18S/28S pieken geven RNA degradatie. Dit blijkt ook uit in de virtuele gel (D).
Figuur 3:. MRNA kwaliteitscontrole A + B) Electropherogram (A) en virtuele gel (B) met vermelding van het mRNA-transcript Length (spread) die noodzakelijk zijn voor microarray studies, dat wil zeggen tot voorbij 600 nucleotiden (nt). C + D) Electropherogram (C) en virtuele gel (D) laten zien wat een onvoldoende mRNA zich eruit zou zien, als het mRNA-transcript lengte niet voorbij 200nt.
Discussion
Hier proberen we een protocol aan te passen aan homogene cel populaties uittreksel uit heterogene post-mortem hersenweefsel met behulp van de Arcturus XT-systeem en de bijbehorende RNA-extractie kits. Zoals hierboven is aangegeven, hebben we enkele wijzigingen aan de oorspronkelijke protocollen die door het bedrijf, om RNA integriteit te maximaliseren. De succesvolle vastleggen van enkele cellen hangt uitsluitend af van het optimaliseren van de stappen voorafgaand aan de vast te leggen in om een maximale cellen met een goede RNA te bereiken. Deze stappen zijn de verschillende parameters in verband met weefsel snijden en vlekken. Kortom, met betrekking tot het prepareren van weefsels deze omvatten: 1) het verminderen van de temperatuurgradiënt bij snijden, 2) alleen het plaatsen van twee delen per slide, 3) het uitvoeren van alle uitdroging stappen op het ijs, 4) het toevoegen van RNase Inhibitor de vlek, 5) steeds meer de uitdroging duur in de laatste 100% ethanol tot 3 minuten.
Met betrekking tot het vastleggen, voelen we dat de combinatie van CapSure HS caps, met de software op macro-instelling, moet een optimaal resultaat. Een vocht-gecontroleerde omgeving is cruciaal voor het vastleggen van enkele cellen, zoals een hoge luchtvochtigheid drastisch vermindert weefsel "lift". Hoge temperaturen kunnen ook een negatief effect hebben op de RNA-kwaliteit.
Tijdens de RNA-isolatie protocol met de PicoPure kit, zijn er twee wasstappen. Het is belangrijk om te controleren dat alle wasbuffer is verwijderd voordat de overdracht aan een andere microcentrifugebuis voor RNA-elutie, zoals elke aanwezigheid van de buffer in uw uiteindelijke steekproef zal resulteren in minder vanaf RNA voor versterking. Om dit te waarborgen, hebben we centrifuge de laatste wasstap voor 2,5 minuten in plaats van 2 minuten zoals voorgesteld in de daarvoor bestemde protocol.
Voor het grootste deel, de lineaire versterking protocol was volgens de instructies van de fabrikant. Er dient echter twee cruciale punten in aanmerking worden genomen bij het gebruik van dit protocol: 1) proberen om het verlies van RNA te beperken via meer dan het overbrengen van de monsters tussen de buizen door het gebruik van alleen de 0,5 ml buisjes die in combinatie met een 0,5 ml blok in de thermal cycler , en 2) bij het overbrengen van het monster op de kolom voor zuivering zuivering van cDNA, moet u de spin down monsterbuizen na de eerste overdracht. Dit zal resulteren in een extra 1-2ul van het monster toe te voegen aan de zuivering kolom en kan daarom cDNA herstel te vergroten.
Bij het maken van het gebruik van de TURBO end-labelling kit voor biotine-etikettering van uw beperkte ARNA samples, we raden het toevoegen van een extra paar ul van water voor de centrifugatie stap, het vergroten van de gelabelde RNA opbrengst uit de kolom. Een extra minuten van centrifugeren zal ook helpen in dit opzicht, vooral als u werkt met een afgebroken weefsel, zoals FFPE weefsel.
We zijn ervan overtuigd dat dit protocol in staat zal stellen de gebruiker in kleine homogene structuren, zoals de enkele cel populaties, binnen heterogene postmortem hersenweefsel te isoleren. Dit vermindert verwateringseffect van de omliggende structuren en andere cel-types in de verschillende lagen in de hersenen, wat leidt tot resultaten gericht op de specifieke celtypen in onderzoek. Omdat de kwaliteit van de resulterende RNA is goed genoeg voor microarray studies, kunnen we beginnen met specifieke moleculaire handtekeningen van specifieke cel getroffen bevolking bij de ziekte van staten lokaliseren.
Disclosures
De productie van deze video-artikel werd gesponsord door Life Technologies.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen Molecular Devices Analytische technologieën / Arcturus voor hun genereuze donatie van reagentia wordt gebruikt voor de studie. We danken ook de Harvard Tissue Resource Center voor het leveren van post-mortem menselijk hersenweefsel Financiering:. RO1MH76060 en P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
