Summary
Se describe un procedimiento que utiliza láser microdisección de captura para aislar y extraer el ARN de una población celular homogénea, las neuronas piramidales en la capa III de la circunvolución temporal superior en los cerebros humanos postmortem. Estamos posteriormente amplifican linealmente (T7-based) mRNA, y se hibridan la muestra a la Affymetrix humanos X3P microarrays.
Abstract
Nos propusimos investigar la reducción de materia gris en el gyrus temporal superior se ve en pacientes con esquizofrenia, interrogando a los perfiles de expresión génica de las neuronas piramidales de la capa III. Es bien sabido que la corteza cerebral es una estructura extraordinariamente heterogéneo que comprende las diversas regiones, capas y tipos de células, cada una de ellas se caracteriza por diferentes composiciones moleculares y celulares y por lo tanto, los perfiles de genes de expresión diferencial. Para evitar los efectos de confusión de la heterogeneidad del tejido, que utiliza láser de captura de microdisección (LCM) con el fin de aislar a nuestro tipo específico de células-es decir, las neuronas piramidales.
Aproximadamente 500 neuronas piramidales se tiñeron con la solución de tinción HistoGene fueron capturados utilizando el sistema de Arcturus XT LCM. Se aisló el ARN de las células luego capturado y sometido a dos rondas de T7 basada en la amplificación lineal utilizando Arcturus / kits Molecular Devices. El LabChip Experion (Bio-Rad) y gel electroferograma indica la buena calidad de un ARN (m), con una transcripción de longitud se extiende 600nt últimos necesarios para microarrays. La cantidad de ARNm obtenido un promedio de 51μg, con una pureza aceptable media de la muestra, como se indica por la relación A260/280, de 2,5. La expresión génica se perfila con los humanos X3P serie sonda GeneChip de Affymetrix.
Protocol
1) Tejidos de seccionamiento:
Se obtuvo el tejido necesario (control n = 9, la esquizofrenia n = 9) en el Centro de Recursos de tejido cerebral de Harvard, de la misma intervalo de edad, sexo y postmortem (PMI) (Tabla 1). El nitrógeno líquido bloques de vapor fue de aproximadamente 3 mm de espesor fueron tomadas del área de Brodmann 42 (circunvolución temporal superior).
Antes de comenzar la tinción de las neuronas piramidales, las condiciones deben ser optimizados con el fin de obtener tejido óptimo "levantar" y de alta calidad del ARN. Tejido "levantar", describe el proceso de microdisección láser durante la captura, donde las neuronas marcadas para la captura de adherirse a la tapa y se separan, mientras que el resto del tejido se queda atrás.
Optimización:
- Con el fin de reducir la actividad RNasa, lo que compromete la calidad del ARN, el tratamiento de todas las superficies, incluyendo el área de trabajo, corte la hoja y se desliza con una solución de descontaminación RNasa como RNasa Zap ®, además de lavarlo con etanol al 100%.
- Sección del tejido con el criostato fijado en -17 ° C. Esto reduce el gradiente de temperatura entre la temperatura ambiente (diapositivas), el criostato, y el hielo seco (véase el proceso completo más abajo). Si la temperatura es inferior a -20 ° C, las secciones de tejido tienden a triturar, inutilización. Superior, y que aumenta el gradiente de temperatura, que pueden poner en peligro la integridad del ARN.
- Las secciones deben ser 8μm gruesas, como las secciones más gruesas en última instancia, comprometer los tejidos "levantar". Este espesor también permite la identificación correcta de las neuronas piramidales de la captura.
- Utilice láminas de vidrio plano sin carga (por ejemplo, HistoGene ™ LCM diapositivas) ya que estos no interfieran con el tejido "levantar" durante el proceso de captura de láser. Diapositivas de membrana también se puede utilizar, pero estos son más adecuados para aislar grandes estructuras de los tejidos, como la membrana tiende a levantar un poco durante el proceso de captura por láser, lo que aumenta los rayos infrarrojos (IR) el tamaño del punto láser y la disminución de la especificidad de la célula.
- Montar dos secciones por placa de vidrio, ya que más de dos secciones en cada diapositiva puede comprometer la calidad del ARN debido a la constante variación de la temperatura durante el proceso de corte.
- Después de cortar, colocar los portaobjetos inmediatamente en una caja de diapositivas micro en hielo seco a fin de preservar la integridad del ARN. Cajas de diapositivas que contienen las secciones del cerebro son posteriormente almacenadas a -80 ° C hasta su transformación.
Hemos determinado que las neuronas piramidales, a 500 células por caso, son adecuados para la adquisición de ARN suficiente para la hibridación de microarrays. Aproximadamente cuatro secciones son necesarios por caso, debido principalmente a la sección y tinción artefactos.
2) La tinción de las neuronas piramidales:
Identificación de las neuronas piramidales se logra con la solución de tinción HistoGene ™ rápido y kit, ya que nos permite visualizar estas neuronas, sin que la exposición prolongada a las soluciones acuosas, con lo que la preservación de ARN.
- Preparación para el procedimiento de tinción mediante la adición de inhibidor de RNasa 1μl por 100μl de solución de tinción (por ejemplo, Promega) con el fin de limitar la actividad RNasa. Cuatro secciones (2 diapositivas), requieren 4μl de inhibidor de RNasa añade 400μl de la solución de tinción HistoGene en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (se mantuvo en hielo). Para cada sección, se utiliza 97μl de esta solución, que nos da una adecuada tinción para identificar las neuronas piramidales.
- Preparar una serie de deshidratación y el xileno: 25 ml de la alícuota correspondiente a la etanoles cubetas suministrado con el kit HistoGene, es decir, 2x75%, 95%, 100% y 2 jarras de agua libre de RNasa. Coloque todos los frascos en un cubo de hielo, a excepción de un frasco de 75%, que se colocan en el congelador a -20 ° C. Bajo una campana extractora, añadir filtros moleculares en el frasco xileno para eliminar el exceso de agua, lo que podría poner en peligro el tejido "levantar".
- Encienda el baño de agua (o bloque de calor) con la temperatura a 42 ° C y colocar un tubo Falcon de 50ml con el apoyo de una rejilla en el tanque.
- Retire los dos diapositivas de -80 ° C y descongelar ellos en un KIMWIPE durante aproximadamente 30 segundos, o hasta que las esquinas de las diapositivas empiezan a descongelar.
- En pocas palabras arreglar las diapositivas en el etanol al 75% durante 30 segundos en el congelador a -20 ° C. Transferencia de las diapositivas entre cubetas con RNasa zapped pinzas para reducir la contaminación.
- Después de un lavado de 30 segundos en agua libre de nucleasa, las secciones pueden ser descritos con una pluma barrera PAP con el fin de concentrar la solución de la sección, sin embargo, con la lámina de vidrio claro que esto no es absolutamente necesario.
- Tinción de las cuatro secciones con la solución de tinción HistoGene durante 20 segundos, con 97μl del inhibidor de la mancha / RNasa por sección. Posteriormente, se deshidratan las secciones de la etanoles previamente preparado en el hielo, durante 30 segundos por paso. El último paso de etanol al 100% debe serampliarse hasta los 3 minutos, con el fin de lograr una deshidratación suficiente para que los tejidos adecuados "levantar" y la captura en las tapas de LCM.
- Sumerja los portaobjetos en xileno durante 5 minutos y secar al aire en una campana de humos, por otros 5 minutos antes de la captura.
Los pasos de tinción sólo debe realizarse si la captura por láser inmediatamente después. Todas las soluciones se deben cambiar cada 4-6 diapositivas con el fin de evitar la contaminación y para garantizar la correcta deshidratación.
3) una única célula láser microdisección de captura:
Después de la tinción, las neuronas piramidales de la capa III se eliminan con láser microdisección de captura, con el sistema de Arcturus XT ™ y el software. En pocas palabras, el sistema funciona por pulsos una fuerza ajustable láser de infrarrojos a través de una película termoplástica situada en la base de un tope, lo que resulta en la extensión / distensión de la película directamente en las células de interés. Cuando la tapa se levanta el tejido, las células permanecen capturados / sujeción de la tapa. Un resumen pictórico se da en la figura 1.
Antes de iniciar este procedimiento, es importante distinguir entre los dos tipos de tapas disponibles con este sistema. Mientras que la tapa CapSure Macro se utiliza generalmente para la captura de grandes estructuras de los tejidos, las tapas SA CapSure ™ están diseñados para capturar un pequeño número de células individuales y por lo tanto, estas tapas tienen una menor superficie designada para la captura. Las tapas SA también tiene rieles que evitan que la tapa de estar en contacto directo con la sección de tejido, mientras que la tapa del Macro no. Estos carriles reducir el efecto de plegado de tejidos que puedan afectar o inducir a la variabilidad del tamaño de la mancha (del pulso láser) como la tapa del Macro se encuentra directamente en plegado, tejido irregular. Para nuestro procedimiento, que utiliza las tapas SA para aprovechar su capacidad para reducir el efecto del plegamiento de tejidos, pero mantiene la configuración de tapa Macro en el software con el fin de maximizar el área de captura como son la captura de un gran número de células.
- Carga las diapositivas y las tapas en el aparato de Arcturus XT ™. Utilice el CapSure ™ SA topes, pero mantener la configuración del programa de Macro. Haga clic en la casilla "Cargar con vista" para obtener una visión general de fotos de cada diapositiva.
- Ajustar el brillo / foco con un aumento de 2x, con el fin de determinar qué sección sería óptimo para la captura de láser. Evitar los cortes de tejido con el plegado excesivo, sino elegir las secciones que están intactos, sin problemas, y se tiñen bien, sobre todo cerca de la región de interés, es decir la capa III.
- A continuación, coloque una tapa sobre el área general donde se captura, asegurándose de incluir la capa III. Aún en la magnificación 2x, asegúrese de que los carriles de la tapa no se duerma en los pliegues, ya que esto la inclinación de la tapa.
- A continuación, confirmar la ubicación del punto láser IR manualmente en el aumento de 40x. Si el punto (haz rojo) no se correlaciona con la cruz azul, esto se puede ajustar haciendo clic derecho sobre el terreno y la selección de "punto situado IR".
- A 40x, podemos comenzar a identificar las neuronas piramidales de acuerdo a los siguientes criterios (1) las células que son de forma piramidal y (2) la porción proximal de las dendritas apicales y / o basal son identificables (Fig. 1A).
Ahora ajustar la potencia y la duración del pulso láser con el fin de capturar la neurona piramidal. Esto es particularmente importante, ya que determina la especificidad de la célula capturado, además del número de células capturadas. Si el pulso es muy débil, no todas las neuronas identificadas serán capturados, mientras que si el pulso es demasiado fuerte, puede capturar alrededor de las células del tejido / que no sea la neurona sola. Por lo general, con las especificaciones de tejidos y células empleadas aquí, la fuerza de láser (70MW) y duración (16msec) dan como resultado un tamaño de punto de 25μm, aproximadamente en línea con el tamaño de las neuronas piramidales (Fig. 1B). Sin embargo, estos valores están bien afinados para cada sección a fin de obtener más o menos el tamaño mismo lugar por caso. Si "levantar" se ve comprometida, siempre se puede aumentar el número de células capturadas con el fin de mantener la cantidad de ARN obtenido de cada caso comparable. Sin embargo, asegúrese de mantener el tiempo de captura incluyendo manchas menos de 1,5 horas, ya que esto puede comprometer la calidad del ARN.
- En primer lugar guardar la posición de la tapa haciendo clic en el signo más en la función de posición. De esta manera, si por alguna razón tenemos que quitar la tapa y luego necesidad de poner de nuevo en el mismo lugar, la tapa siempre volverá a precisamente el mismo lugar que se ajusta el tamaño del punto de.
- Introduzca estos valores en la caja de control: 70 en el poder y 16 en la duración. Desactive el "mover automáticamente las etapas" opción, y asegúrese de que el símbolo de tamaño adecuado se correlaciona con el símbolo en el panel de la derecha.
- Seleccione la opción del círculo (abajo a la derecha) para seleccionar una neurona que le gustaría tesla captura de t, y luego activar el láser, haga clic en "prueba rápida IR".
- El terreno efectuadas por el láser en primer lugar debe tener un anillo oscuro alrededor de la nítidas de objetos capturados. Si este anillo es demasiado clara, la célula no fue capturado. Si hay una mancha oscura en el centro del anillo oscuro, entonces la fuerza de láser / duración es demasiado grande, y que podría tener un efecto negativo en el ARN presente en la célula capturada. Asegúrese de que el anillo es lo suficientemente grande como para abarcar la celda, pero lo suficientemente pequeño que no incluye el tejido no deseado o de otras células.
- Repita el proceso en diferentes partes del tejido dentro de la capa que desea capturar, para comprobar que el tamaño del punto no difiere dependiendo de la ubicación. Los ajustes correspondientes.
- Una vez que el punto del láser ha sido ajustado, continúan para identificar las neuronas piramidales de la captura. Identificamos aproximadamente 500 células por muestra, lo que resulta en aproximadamente 500pg de ARN total por muestra. También por lo general solo se usa una sección con el fin de reducir la cantidad de tiempo de captura, como la tapa tiene que ser reajustado para cada sección. Una vez que se han identificado todas las células que necesita, pulse el botón de captura por láser y todas sus células se captura automáticamente en la tapa (Fig. 1C).
- Una vez que todas las células han sido capturados, mover la tapa a una parte diferente de la diapositiva que no contiene una sección. Volver al lugar donde las células fueron capturados y asegúrese de que al menos el 90% de las neuronas se han eliminado. Si no, no trate de recuperar las mismas células, pero localizar el área donde la mayoría de las células fueron capturados, y la captura de más células en la misma zona. Mueva la tapa de la estación de control de calidad.
- Coloque la tapa en el tubo de microcentrífuga de 0,5 ml de Applied Biosystems (cat. # N8010611), que contiene 50 ml de tampón de extracción (PicoPure ® RNA Kit de aislamiento). La PAC ha sido diseñado para encajar perfectamente en este tubo específicas para prevenir el escape de buffer.
- Gire el conjunto de cabeza, asegurándose de que un tampón de extracción cubre el tapón de todo, y lo colocamos en la parte inferior del tubo de 50 ml Falcon ya está presente en el conjunto al baño maría a 42 ° C. Las neuronas se incubaron durante 30 minutos con el fin de eliminar el tejido de la tapa.
- A partir de entonces, centrifugar el tubo y la tapa durante 2 minutos a 800 g. Retire la tapa y guardar el extracto de células restantes a -80 ° C hasta la extracción de RNA. Como precaución adicional, se puede volver a examinar la tapa en la estación de control de calidad sobre el aparato láser de captura para asegurar que todas las neuronas se han eliminado de la propia tapa.
4) La obtención de ARN de las poblaciones neuronales específicas:
Uno puede ir directamente desde la captura al aislamiento, o descongelar la muestra almacenada en el congelador de -80 º C. En nuestro experimento, primero recogido todas las muestras necesarias y las almacenó a -80 ° C antes de proceder al aislamiento de ARN.
El aislamiento de ARN se realiza mediante el PicoPure ® Kit de aislamiento, el cual está diseñado para aislar a un pequeño número de células de las muestras de LCM y retener bajo la abundancia de ARNm. En general, seguimos el protocolo que se incluye en el kit. A continuación, se da una descripción básica del proceso.
- Después de descongelar, añadir etanol al 70% (suministrado con el kit) y se centrifuga en una columna de purificación pre-acondicionado con el fin de obligar a la ARN para el filtro de la columna.
- Después del lavado, el tratamiento de la ARN con DNasa con el fin de asegurar la eliminación completa de ADN para eliminar el riesgo de interferencia de ADN. Este paso es especialmente importante en las aplicaciones posteriores, como en tiempo real QRT-PCR.
- Tras la digestión del ADN, hay otro paso de lavado. Compruebe que no haya solución de lavado está en la columna antes de ser transferido a otro tubo de microcentrífuga, ya que cualquier presencia de la memoria intermedia en la muestra final se traducirá en menos de partida para la amplificación del ARN. Para asegurar esto, centrifugar la etapa de lavado final de 2,5 minutos en lugar de 2 minutos como se indica en el protocolo previsto.
- Por último, el tampón de elución y se incuba en el filtro de la columna durante 1 minuto, seguido por centrifugación, con el fin de eluir el RNA total.
- Pipeta 1.3ul de cada una de las muestras por separado en tubos de 0,5 ml para ejecutar una Experion HighSens LabChip ®. Congelar el resto de la muestra a -80 ° C.
Control de calidad es muy importante cuando el aislamiento de ARN, especialmente cuando la cantidad es pequeña y la cantidad necesaria, como por ejemplo para experimentos de microarrays (15μg), es grande. El ARN extraído por lo tanto, deben someterse a control de calidad en diversos momentos durante el proceso. La primera se produce después de la extracción. Establecemos el total integridad del RNA a través de examen macroscópico de los picos de la 18S/28S electroferogramas y gel virtual generada por Experion ™ HighSens LabChip ®. Este método es rápido y dispone de dos aparatos de medida para comprobar la calidad del ARN-un electroferograma y avIRTUAL gel (Fig. 2). Si la calidad del ARN total es relativamente buena (Fig. 2A, B vs C, D), entonces procedemos con linealmente amplificar el ARNm, que representa aproximadamente el 2% del total de ARN.
5) la amplificación lineal:
La amplificación de ARN extraído de láser capturados los tejidos es necesaria para producir una cantidad adecuada de ARN para la hibridación de microarrays y posteriores experimentos de QRT-PCR. Con el fin de minimizar la posibilidad de señalar el potencial confunde con T7 basada en la amplificación lineal, se minimiza el número de rondas de amplificación necesaria por la maximización de la cantidad de la puesta en marcha por láser capturado materiales tejidos.
Nuestros datos preliminares (no se muestra) sugiere que dos rondas de amplificación lineal (RiboAmp ® HS PLUS kit) de ARN total extraído de los tejidos que contienen aproximadamente 500 células que producen aproximadamente 50 microgramos de Arna - suficiente para el desempeño de los microarrays y QRT- PCR experimentos. Si es posible, evitar la transferencia innecesaria de la muestra entre 0,2 ml y 0,5 ml tubos mediante el uso de bloques de 0,5 ml en el termociclador y los tubos de 0,5 ml incluye en el kit.
Una vez más, el protocolo seguido es el que viene con el kit. Una versión abreviada que aquí se describe.
- Añadir 1μl de la cartilla siempre que el total de muestras de ARN (aprox. 11μl) y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos, seguido de enfriamiento a 4 ° C durante 1 minuto.
- Añadir primeros componentes cDNA con superíndice ™ III de la transcriptasa inversa y se incuba a 42 ° C durante 1 hora.
- Después de la síntesis de ADNc en segundo lugar, purificar el ADNc resultante a través de una columna de purificación siempre. Aquí le recomendamos que cuando se transfiere la muestra más tampón de unión a la columna de purificación, para centrifugar los tubos de muestra dos veces - una vez después de la transferencia de la muestra a la columna, ya que hasta 1μl de la muestra se mantiene en los lados de los tubos después de la transferencia.
- Lave el cDNA con la tampones de lavado siempre y eluir el cDNA purificado con el tampón de elución.
- Añadir en los componentes de transcripción in vitro y se incuba durante 6 horas a 42 ° C.
- Después de un paso DNasa, purificar el ARNA resultante con los topes siempre, finalmente liberador en un total de 12μl de tampón de elución.
El ARN se somete a una nueva ronda de amplificación lineal (con cebadores por separado - ver kit de protocolo), después de que más medidas de control de calidad se emplean. Una ul de la muestra se diluye a aproximadamente 250ng/ul para determinar la longitud transcripción del mRNA y la concentración con la LabChip StdSens ® (Experion ™). Tradicional tecnología de microarrays Affymetrix requiere que el ARNm de al menos 600 nucleótidos de longitud con el fin de detectar. El gel y electroforetograma obtenido a partir de la LabChip ® por lo tanto, debería representar esta longitud mínima de ARNm transcripción (Fig. 3).
Un control de calidad adicional se determina mediante un análisis espectrofotómetro NanoDrop, en una relación de hecho de dos densidades ópticas, es decir, A260 y A280, que determina la pureza del ARN. Las muestras con una densidad óptica en torno al 2,1 deben ser etiquetados para el análisis de expresión génica, aunque los coeficientes de hasta 2,7 han demostrado tener una calidad comparable hibridación. La concentración también debe estar entre 800ng/μl-1μg/μl, como menor que lo que ha llevado a la degradación del ARN durante el almacenamiento (incluso a temperaturas inferiores a -80 ° C) y también ha llevado a los resultados de microarrays pobres.
6) La biotina-etiquetado de las muestras de ARNm para el análisis de microarrays Affymetrix:
El TURBO kit biotina etiquetado (de fin de etiquetado) de Molecular Devices se utiliza para etiquetar los ARNA obtenidos de las muestras amplificadas. Una versión abreviada del protocolo se da aquí.
- Ajustar el volumen de 20 mg de cada muestra ARNA con el total de 13μl mediante la adición de agua libre de nucleasa o mediante la concentración de la muestra en una centrífuga de vacío, en función de la concentración inicial. A pesar de que sólo 15μg es necesario para el chip de Affymetrix utilizado, sumamos 20 microgramos de la reacción inicial, ya que algunos ARN se pierde durante la incubación y centrifugación.
- Incubar la reacción biotina a 85 ° C durante 30 minutos, y luego enfriar a 4 ° C.
- Quite la etiqueta de exceso de biotina a través de centrifugación con la columna especializados incluidos en el kit. En algunos casos, especialmente con el ARNm degradadas, como la que se obtiene a partir de FFPE (fijado en formol e incluidos en parafina) muestras, podría darse el caso de que no todos los ARNm se eluye en el paso de centrifugación simple. A continuación, se recomienda añadir entre 1-5μl adicional agua libre de nucleasa de la columna con un paso posterior centrifugación adicional de 1 minuto. Esto asegura que la mayor parte de la muestra se eluye la etiqueta.
- El volumen final es 20μl, conuna concentración de 1μg/μl. Si adicional libre de nucleasa se añadió agua, el concentrado de las muestras con el volumen correcto con una centrífuga de vacío. Se recomienda mantener la concentración de almacenamiento antes de comenzar la hibridación en 800ng/μl, como hemos encontrado que menos que esto dará lugar a la degradación durante el almacenamiento y / o hibridación resultante de los resultados de microarrays pobres.
ARNA fue hibridada y la expresión génica perfil, utilizando el GeneChip Human X3P ® serie de la sonda de Affymetrix ®. Como este chip fue diseñado para obtener más ARNA degradados, lo utilizamos como medida de precaución, ya que muchos factores que no podemos controlar pueden afectar la calidad del tejido postmortem. A medida que nuestro laboratorio no cuentan con las instalaciones adecuadas para la hibridación, el proceso se llevó a cabo en las instalaciones principales socios Genómica.
Los resultados representativos:
Un tejido +2 +3) el corte, la tinción de las neuronas piramidales y microdisección láser de captura:
El protocolo descrito anteriormente debería resultar en dos diapositivas con cuatro secciones en cada diapositiva. Cada sección debe ser suave con mínimas pérdidas provocado desgarros, roturas y plegables. Con la tinción correcta, la mancha se identifican las neuronas piramidales oscuras manchas alrededor de 20 - 25μm de tamaño con una forma piramidal y visible dendritas apicales. Con la CapSure ™ tapas SA en Configuración de macros, y el ajuste correcto de la potencia del láser y la fuerza de cada sección, usted debe obtener alrededor de 500 a 700 células por sección / caja con al menos 500pg de ARN total. Aproximadamente el 85 - 100% de las neuronas se adhiere a la tapa (Fig. 1).
4) La obtención de ARN de las poblaciones neuronales específicas:
Como se describe, después de total de aislamiento de ARN, que compruebe la calidad de ARN por medio de un gel electroferograma y virtuales a través de la Bio-Rad ™ Experion. En el electroferograma, verá que hay dos picos distintos que corresponden a los 18S y 28S del RNA ribosomal unidades. Con el tejido postmortem, sin embargo, esto no siempre es el caso, ya que el tejido puede ser degradado debido a los factores antes de cortar. Normalmente se ve una gran protuberancia que indica la degradación, con un pico grande alrededor de 18S, 28S y un pequeño pico (Fig. 2A, B). Siempre y cuando los perfiles electroferograma son comparables a través de muestras, hemos encontrado esta guía para producir una calidad de ARNm lo suficientemente bueno para llevar a cabo ambos estudios de RT-PCR y microarrays (Imbeaud et al., 2005).
Si hay una degradación demasiado - como se indica en una gran área bajo la curva de la electroferograma, o si los picos no son visibles (Fig. 2C, D) - las células deben ser capturados de nuevo desde el tejido. También se recomienda hacer una prueba de tejido raspar, donde el ARN se extrae a partir de fragmentos de toda la sección (no sólo las células), antes de recuperar las células para determinar si el bloque de tejido en sí se degrada.
5) la amplificación lineal:
Para probar la calidad de los ARNm tras dos rondas de amplificación lineal, hemos hecho uso tanto de la Bio-Rad Experion ™ ® StdSens LabChip y el espectrofotómetro NanoDrop. Tradicional tecnología de microarrays Affymetrix requiere que el ARNm de al menos 600 nucleótidos de longitud con el fin de detectar, que se obtuvo con este protocolo. De hecho, las longitudes de mRNA se detectó en el rango de 1000-nucleótidos. El electroferograma también refleja esto con grandes picos descendiendo lentamente en función del tiempo (Fig. 3A, B).
Las lecturas NanoDrop indicó un promedio A260/A280 proporción de 2,5 a través de muestras, lo que indica ARNm viables (Tabla 2).
Nuestros resultados indican que con este protocolo, la cantidad y la calidad del ARN obtenido es lo suficientemente bueno para interrogar a las diferencias de expresión de genes a través de la Affymetrix GeneChip ® humanos X3P.
6) La biotina-etiquetado de las muestras de ARNm para el análisis de microarrays Affymetrix:
Después de la hibridación de la Affymetrix GeneChip ® humanos X3P, hemos logrado llamadas por ciento de un promedio de 26,6% (Tabla 2), lo que indica la hibridación y la adecuada intensidad de la sonda.
Tabla 1: Resumen de cohortes
| Muestras | Grupo | Sexo | Edad | PMI |
| C1 | CONTROL DE | F | 79 | 15.00 |
| C2 | CONTROL DE | M | 22 | 21.47 |
| C4 | CONTROL DE | M | 75 | 20.25 |
| C5 | CONTROL DE | M | 80 | 15.50 |
| C6 | CONTROL DE | F | 58 | 21.08 |
| C8 | CONTROL DE | M | 61 | 17.00 |
| C10 < / Td> | CONTROL DE | F | 71 | 20.50 |
| C11 | CONTROL DE | F | 90 | 12.66 |
| C12 | CONTROL DE | F | 86 | 6.92 |
| MEDIA | 4M/5F | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21.40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21.80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22.00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17.97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10.75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17.80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21.83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13.33 |
| MEDIA | 4M/5F | 68.11 | 16.90 |
Abreviaturas: F - M femenina, - PMI Hombre, - intervalo post mortem, schizoph. - Esquizofrenia.
Tabla 2: Resumen de los resultados que muestra la concentración de ARN, la calidad y la eficiencia de la hibridación
| Muestras | [ARNm] ng / ul | A260/A280 | Sonda de intensidad | Porcentaje de llamadas |
| C1 | 1.318,01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2.312,93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1.811,92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1.316,26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1.663,24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633,05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994,24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817,23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2.560,88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2.169,61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2.067,32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1.563,89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| S5 | 2.071,44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| S6 | 2.532,59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2.189,22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1.669,89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1.739,35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| MEDIA | 1.708,75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
Figura 1:. Resumen del proceso de microdisección láser de captura A) Las neuronas piramidales se identifican morfológicamente. B) Después de que el láser se ha pulsado a través de la película termoplástica, las células se adhieren a la tapa y por lo tanto ya no está en la diapositiva, dejando los tejidos circundantes atrás. C) Microfotografía de una población celular homogénea adherido a la CapSure Cap ™ después de la captura de láser.
Figura 2:. Control total de la calidad del ARN A + B) Representa el ARN total de buena calidad después de su aislamiento, mientras que C + D) ilustra lo que el total de ARN que no debe verse como después de su aislamiento. A) Un electroferograma con claros picos 18/28S correspondiente con el gel virtual en (B). C) Un electroferograma mostrando una gran área bajo la curva y sin picos 18S/28S que indica la degradación del ARN. Esto también se muestra en el gel virtual (D).
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Figura 3: Control de calidad del ARNm A + B) Electroferograma (A) y virtuales gel (B) que indica la longitud transcripción de ARNm (extensión) necesarias para los estudios de microarrays, es decir, extender últimos 600 nucleótidos (nt).. C + D) Electroferograma (C) y virtual de gel (D) muestra lo que un diferencial de ARNm se parecería insuficiente, como la longitud transcripción de ARNm no se extiende 200nt pasado.
Discussion
En este caso, se intenta personalizar un protocolo para extraer poblaciones homogéneas de células del tejido cerebral postmortem heterogéneos utilizando el sistema de Arcturus XT ™ y relacionados con los kits de extracción de RNA. Como se mencionó anteriormente, hemos hecho algunas modificaciones en los protocolos originales proporcionados por la empresa, con el fin de maximizar la integridad del ARN. La captura exitosa de células individuales depende exclusivamente de la optimización de los pasos antes de la captura con el fin de lograr la máxima células con ARN buena. Estas etapas incluyen los diversos parámetros asociados con el tejido seccionado y tinción. En resumen, en lo que respecta a la preparación de los tejidos que incluyen: 1) la disminución del gradiente de temperatura en la sección, 2) sólo la colocación de dos secciones por diapositiva, 3) realizar todos los pasos de la deshidratación en el hielo, 4) la adición de inhibidor de RNasa de la mancha 5), el aumento la duración de la deshidratación en la final de etanol al 100% a 3 minutos.
En cuanto a la captura, creemos que la combinación de tapas CapSure ™ SA, con el software de configuración de la macro, debe garantizar resultados óptimos. Un ambiente con humedad controlada es fundamental para captar células individuales, como la alta humedad reduce drásticamente el tejido "levantar". Las altas temperaturas también pueden tener un efecto negativo en la calidad del ARN.
Durante el protocolo de aislamiento de ARN con la PicoPure ® kit, hay dos pasos de lavado. Es importante comprobar que todos los tampón de lavado se elimina antes de ser transferido a otro tubo de microcentrífuga de elución de ARN, ya que cualquier presencia de la memoria intermedia en la muestra final se traducirá en menos de ARN de partida para la amplificación. Para asegurar esto, centrifugar la etapa de lavado final de 2,5 minutos en lugar de 2 minutos como se indica en el protocolo previsto.
En su mayor parte, el protocolo de amplificación lineal de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Sin embargo, dos puntos cruciales deben ser tenidos en cuenta cuando se utiliza este protocolo: 1) tratar de limitar la pérdida de ARN a través de la transferencia de exceso de muestras entre los tubos, usando solamente los tubos de 0,5 ml suministra junto con un bloque de 0,5 ml en el termociclador y 2) la hora de transferir la muestra a la columna de purificación para la purificación de cDNA, asegúrese de girar los tubos de muestra después de la primera transferencia. Esto se traducirá en un adicional de 1 2UL de ejemplo para agregar a la columna de purificación y por lo tanto, puede aumentar la recuperación de cDNA.
Al hacer uso de la TURBO ™ de fin de etiquetado kit de biotina-etiquetado de las muestras ARNA limitado, se sugiere añadir un extra de unos pocos l de agua antes de la etapa de centrifugación, para aumentar el rendimiento de ARN marcado extraído de la columna. Un minuto adicional de la centrifugación también ayudará en este sentido, sobre todo si se trabaja con tejidos degradados, como el tejido FFPE.
Estamos seguros de que este protocolo permitirá al usuario para aislar pequeñas estructuras homogéneas, como las poblaciones de células individuales, dentro del tejido cerebral postmortem heterogéneo. Esto reduce los efectos de dilución de las estructuras circundantes y otros tipos de células ubicadas en las diversas capas del cerebro, dando lugar a resultados dirigidos a los tipos de células específicas de investigación. Como la calidad de la resultante de ARN es lo suficientemente bueno para los estudios de microarrays, podemos empezar a identificar firmas moleculares específicas de las poblaciones de células específicas afectadas en los estados de enfermedad.
Acknowledgments
Agradecemos Molecular Devices tecnologías analíticas / ™ Arturo por su generosa donación de los reactivos utilizados para el estudio. También agradecemos a los tejidos de Harvard, Centro de Recursos para proporcionar el tejido postmortem del cerebro humano Financiación:. RO1MH76060 y P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
