Summary
Descriviamo un processo che utilizza laser-capture microdissezione per isolare ed estrarre l'RNA da una popolazione omogenea di cellule, neuroni piramidali, nello strato III del giro temporale superiore nel cervello umano post-mortem. Successivamente abbiamo linearmente amplificare (T7-based) mRNA, e ibridare il campione umano X3P microarray Affymetrix.
Abstract
Abbiamo proposto di indagare la riduzione di materia grigia nella circonvoluzione temporale superiore osservato nei pazienti schizofrenici, interrogando profili di espressione genica dei neuroni piramidali dello strato III. E 'noto che la corteccia cerebrale è una struttura estremamente eterogenea composta da diverse regioni, i livelli e tipi di cellule, ognuna delle quali è caratterizzata da diverse composizioni cellulari e molecolari e di conseguenza differenziale profili di espressione genica. Per aggirare gli effetti confondenti di eterogeneità del tessuto, abbiamo usato la cattura microdissezione laser (LCM) al fine di isolare il nostro specifico tipo cellulare cioè neuroni piramidali.
Circa 500 neuroni piramidali colorate con la soluzione colorante Histogene sono stati catturati utilizzando il sistema di LCM Arcturus XT. RNA è stato poi isolato dalle cellule catturati e sottoposti a due giri di T7-based amplificazione lineare utilizzando Arturo / molecolare kit Devices. Il LabChip Experion (Bio-Rad) gel e elettroferogramma indicato di qualità ad un (m) RNA, con una lunghezza trascrizione estendere 600nt passato necessari per microarray. La quantità di mRNA ottenuto una media di 51μg, con accettabile purezza media del campione, come indicato dal rapporto A260/280, di 2,5. Espressione genica è stata profilata utilizzando il Umani X3P serie sonda GeneChip da Affymetrix.
Protocol
1) Tessuto di sezionamento:
Abbiamo ottenuto il tessuto necessario (controllo n = 9, schizofrenia n = 9) dal Centro Risorse Cervello Harvard tessuto, abbinati per l'intervallo di età, sesso e post-mortem (PMI) (Tabella 1). Vapori di azoto liquido blocchi sono stati di circa 3 mm di spessore sono stati prelevati dalla zona di Brodmann 42 (giro temporale superiore).
Prima di iniziare la colorazione di neuroni piramidali, condizioni devono essere ottimizzate al fine di ottenere ottimale dei tessuti "portanza" e di alta qualità RNA. Tessuto "lift" descrive il processo durante la cattura microdissezione laser, in cui i neuroni marcati per catturare aderire il tappo e sono separati, mentre il tessuto rimanente è lasciato alle spalle.
Ottimizzazione:
- Al fine di ridurre l'attività RNasi, che compromette la qualità dell'RNA, trattare tutte le superfici, compreso l'area di lavoro, il sezionamento lama e diapositive con una soluzione di decontaminazione RNasi, come RNasi Zap, oltre a pulire giù con il 100% di etanolo.
- Sezione del tessuto con il criostato fissato a -17 ° C. Questo riduce il gradiente di temperatura tra la temperatura ambiente (diapositive), il criostato, e il ghiaccio secco (vedi l'intero processo di seguito). Se la temperatura è inferiore a -20 ° C, le sezioni di tessuto tendono a distruggere, rendendoli inutilizzabili. Più in alto, e la temperatura aumenta pendenza, che può compromettere l'integrità dell'RNA.
- Le sezioni devono essere 8μm di spessore, come più spesso sezioni alla fine compromesso tessuto "lift". Questo spessore consente inoltre la corretta identificazione dei neuroni piramidali per la cattura.
- Usa pianura vetrini scarica (ad esempio Histogene diapositive LCM) in quanto questi non interferiscono con il tessuto "lift" durante il processo di acquisizione laser. Diapositive a membrana possono essere utilizzati anche, ma queste sono più adatti ad isolare le strutture di tessuto di grandi dimensioni, come la membrana tende a sollevare un po 'durante il processo di acquisizione laser, aumentando così la porta a infrarossi (IR) dimensione dello spot laser e diminuire la specificità delle cellule.
- Montare due sezioni per ogni vetrino, come più di due sezioni per vetrino potrebbero compromettere la qualità dell'RNA dovuta alla variazione di temperatura costante durante il processo di sezionamento.
- Dopo sezionamento, posto immediatamente i vetrini in una scatola di diapositive micro in ghiaccio secco al fine di preservare l'integrità dell'RNA. Scatole diapositiva contenente le sezioni cervello sono poi conservati a -80 ° C fino elaborati.
Abbiamo già stabilito che per i neuroni piramidali, 500 cellule per caso sono adeguati al fine di acquisire RNA sufficiente per l'ibridazione di microarray. Circa quattro sezioni sono necessari per caso, soprattutto a causa di sezionamento e colorazione artefatti.
2) colorazione dei neuroni piramidali:
Identificazione dei neuroni piramidali si ottiene con la soluzione rapida colorazione Histogene e kit, in quanto ci permette di visualizzare questi neuroni, senza l'esposizione prolungata a soluzioni acquose, preservando così l'RNA.
- Prepararsi per la procedura di colorazione con l'aggiunta di 1ml inibitore RNAsi per 100μl di soluzione colorante (ad esempio Promega) al fine di limitare l'attività RNAsi. Quattro sezioni (2 diapositive), richiedono 4μl inibitore della RNasi aggiunti 400μl della soluzione Histogene colorazione in una provetta 1,5 ml (tenuta in ghiaccio). Per ogni sezione, utilizziamo 97μl di questa soluzione, che ci dà una macchia adeguati per individuare i neuroni piramidali.
- Preparare serie disidratazione e xilene: 25 ml aliquota del etanoli appropriato nel vaschette di colorazione fornito con il kit Histogene, cioè 2x75%, 95%, 100% e 2 vasetti di acqua RNase-free. Mettere tutti i vasetti in un secchio di ghiaccio, ad eccezione di una giara 75%, che si inserisce nel congelatore a -20 ° C. Sotto cappa, aggiungere setacci molecolari nel barattolo xilene per rimuovere l'acqua in eccesso, che potrebbe compromettere il tessuto "lift".
- Accendere il bagnomaria (o blocco di calore) con la temperatura impostata a 42 ° C e posizionare un tubo da 50 ml Falcon supportato da un rack nel bagnomaria.
- Rimuovere le due diapositive da -80 ° C e sbrinamento su una KimWipe per circa 30 secondi, o anche solo fino agli angoli delle diapositive iniziano a sbrinamento.
- Brevemente fissare le diapositive in etanolo al 75% per 30 secondi nel congelatore di -20 ° C. Trasferire i vetrini tra contenitori per i lavaggi con RNAsi-zapping pinze per ridurre la contaminazione.
- Dopo un lavaggio 30 secondi in acqua priva di nucleasi gli elementi possono essere descritti con una penna barriera PAP al fine di concentrare la soluzione della sezione, ma con il vetrino pianura questo non è assolutamente necessario.
- Macchiare le quattro sezioni con la soluzione Histogene colorazione per 20 secondi, con 97μl dell'inibitore macchia / RNAsi per sezione. Successivamente, disidratano le sezioni in etanoli precedentemente preparato su ghiaccio, per 30 secondi per passo. La fase finale di etanolo al 100% dovrebbe essere esteso a 3 minuti, Al fine di ottenere la disidratazione sufficiente per un adeguato tessuto "portanza" e catturare i tappi sul LCM.
- Immergere i vetrini in xilolo per 5 minuti e asciugare in un fumi-cappuccio per altri 5 minuti prima della cattura.
I passi colorazione deve essere eseguita solo se laser catturare subito dopo. Tutte le soluzioni dovrebbero essere cambiato ogni 4-6 diapositive al fine di prevenire la contaminazione e per garantire adeguata disidratazione.
3) singola cellula laser-capture microdissezione:
Dopo la colorazione, i neuroni piramidali dallo strato III vengono rimossi con laser-capture microdissezione, con il sistema Arcturus XT e software. In breve, il sistema funziona da impulsi laser regolabile forza IR attraverso un film termoplastico situato alla base di un tappo, con conseguente estensione / distensione del film direttamente su cellule di interesse. Quando il tappo viene sollevato dal tessuto, le cellule rimangono catturati / captive sul tappo. Una sintesi pittorica è dato in Figura 1.
Prima di iniziare questa procedura, è importante distinguere tra i due tipi di tappi disponibili con questo sistema. Mentre il tappo CapSure Macro è generalmente utilizzato per l'acquisizione di strutture più grandi tessuti, i cappucci HS CapSure sono progettati per catturare un piccolo numero di singole cellule e quindi questi tappi hanno una superficie più piccola designata per la cattura. I tappi HS anche rotaie che impedisce che il limite di essere in contatto diretto con la sezione di tessuto, mentre il tappo macro non. Queste rotaie ridurre l'effetto di piegare il tessuto che possono influenzare o indurre variabilità della dimensione dello spot (dell'impulso laser) come il tappo del Macro si trova direttamente sulla piegato, tessuto irregolare. Per la nostra procedura, abbiamo usato i tappi SA di sfruttare la loro capacità di ridurre l'effetto di piegare il tessuto, ma tenuto le impostazioni cap Macro dal software al fine di massimizzare l'area catturata come stiamo catturando un gran numero di cellule.
- Caricare i vetrini e cappucci sulla apparato Arturo XT. Uso dei tappi di HS CapSure, ma mantenere l'impostazione sul programma macro. Fare clic su "Carica con panoramica" scatola di ottenere una foto panoramica di ogni diapositiva.
- Regolare la luminosità / messa a fuoco ingrandimento 2x, al fine di determinare quale sezione sarebbe ottimale per laser-capture. Evitare di sezioni di tessuto con la piegatura eccessiva, ma piuttosto scegliere le sezioni che sono intatti, liscio e colorate bene, soprattutto nei pressi della regione di interesse cioè strato III.
- Abbiamo poi posto un tetto sopra la zona generale dove ci sarà la cattura, accertandosi di includere strato III. Ancora l'ingrandimento 2x, assicurarsi che le guide tappo non riposano su una piega, in modo da inclinare il tappo.
- Successivamente, si conferma la posizione del punto laser IR manualmente con l'ingrandimento 40x. Se il punto (rosso raggio) non si correla con la croce blu, questa può essere regolata facendo clic destro sul posto e selezionando "trova posto IR".
- A 40x, possiamo cominciare a identificare i neuroni piramidali secondo i seguenti criteri (1) le cellule che si forma piramidale e (2) la porzione prossimale del dendriti apicali e / o basali sono identificabili (Fig. 1A).
Ora regolare la potenza e la durata degli impulsi laser al fine di catturare il neurone piramidale. Ciò è particolarmente importante, poiché determina la specificità della cellula catturati in aggiunta al numero di cellule catturate. Se l'impulso è troppo debole, non tutti i neuroni identificati saranno catturati, mentre se l'impulso è troppo forte potrebbe catturare il tessuto circostante / altre cellule che il neurone da solo. In generale, con le specifiche di tessuti e cellule impiegate qui, la forza laser (70 mW) e durata (16msec), risultato in uno spot di 25 micron, circa in linea con le dimensioni dei neuroni piramidali (fig. 1B). Tuttavia, queste impostazioni sono ottimizzati per ogni sezione al fine di ottenere o meno la stessa dimensione posto per caso. Se "lift" è compromessa, si può sempre aumentare il numero di cellule catturate al fine di mantenere la quantità di RNA ottenuti da ciascun caso analogo. Tuttavia, essere sicuri di mantenere il tempo di acquisizione tra cui colorazione meno di 1,5 ore, più di questo può compromettere la qualità del RNA.
- In primo luogo salvare la posizione del tappo facendo clic sul segno più alla funzione posizione. In questo modo, se per qualsiasi motivo, dobbiamo togliere il tappo e poi bisogno di rimetterlo nella stessa posizione, il tappo sarà sempre tornare esattamente nello stesso punto che dopo avere regolato la dimensione spot.
- Inserire questi valori nella casella di controllo: 70 in forza e 16 in durata. Deselezionare le "auto spostare stadio" opzione, e assicurarsi che il simbolo giusta dimensione è correlata con il simbolo sul pannello a destra.
- Selezionate l'opzione cerchio (in basso a destra) per selezionare un neurone che si desidera testare la cattura, e quindi attivare il laser cliccandosul "posto di prova IR".
- Lo spot da parte del laser per primo deve avere un anello scuro croccante intorno all'oggetto catturato. Se questo anello è troppo leggero, la cella non è stato catturato. Se c'è una macchia scura al centro del ring scuro, poi la forza laser / durata è troppo grande, e potrebbe avere un effetto negativo sul presente RNA nella cellula catturati. Assicurarsi che l'anello è abbastanza grande per comprendere la cellula, ma abbastanza piccolo che non include i tessuti indesiderate o altre cellule.
- Ripetere il processo su diverse parti del tessuto all'interno del livello che si desidera catturare, per verificare che la dimensione del punto non differisce a seconda della posizione. Regolare di conseguenza.
- Una volta che il punto laser è stato regolato, continuano ad identificare neuroni piramidali per la cattura. Identifichiamo circa 500 cellule per campione, che si traduce in circa 500pg di RNA totale per campione. Noi di solito utilizzare una sola sezione al fine di ridurre la quantità di tempo di acquisizione, come il tappo deve essere riadattato per ogni sezione. Dopo aver identificato tutte le cellule necessarie, premere il pulsante di laser-capture e tutte le tue cellule saranno automaticamente catturati sul tappo (Fig. 1C).
- Una volta che tutte le cellule sono stati catturati, spostare il tappo in una parte diversa della diapositiva che non contiene una sezione. Tornate al punto in cui le cellule sono state catturate e fare in modo che almeno il 90% dei neuroni sono stati rimossi. In caso contrario, non cercare di riconquistare le stesse cellule, ma individuare l'area dove sono stati catturati la maggior parte delle cellule, e catturare più celle nella stessa area. Spostare il tappo alla stazione di controllo di qualità.
- Posizionare il tappo nel tubo da microcentrifuga da 0,5 ml Applied Biosystems (cat. # N8010611) contenente 50 ml di tampone di estrazione (PicoPure RNA Isolation Kit). Il tappo è stato progettato per integrarsi perfettamente in questo tubo specifico per evitare la fuoriuscita del buffer.
- Girare il montaggio a testa in giù, facendo in modo che tampone di estrazione copre il tappo intero, e posizionarlo sul fondo della provetta da 50 ml Falcon già presenti nel set bagnomaria a 42 ° C. I neuroni sono incubate per 30 minuti al fine di rimuovere il tessuto dal tappo.
- Successivamente, centrifugare la provetta e il montaggio tappo per 2 minuti a 800 gr. Togliere il tappo e riporre l'estratto residuo cellulari a -80 ° C fino all'estrazione dell'RNA. Per ulteriore precauzione, è possibile riesaminare il tappo alla stazione di controllo di qualità sui laser apparato di cattura per garantire che tutti i neuroni sono stati rimossi dallo stesso tappo.
4) Ottenere RNA da specifiche popolazioni di neuroni:
Si può andare direttamente dalla cattura di isolamento, o scongelare il campione conservato in congelatore C ° -80. Nel nostro esperimento, abbiamo prima raccolto tutti i prelievi necessari e conservati li a -80 ° C prima di procedere alla RNA isolamento.
Isolamento dell'RNA viene eseguita utilizzando il kit PicoPure isolamento, che è stato progettato per isolare un piccolo numero di cellule da campioni di LCM e di mantenere bassa abbondanza di mRNA. In generale, seguiamo il protocollo che è incluso nel kit. Di seguito, diamo una descrizione di base del processo.
- Dopo lo scongelamento, aggiungere etanolo al 70% (fornito con il kit) e centrifugare su una pre-condizione colonna di depurazione al fine di impegnare l'RNA al filtro colonna.
- Dopo il lavaggio, trattare l'RNA con DNasi al fine di assicurare la completa rimozione del DNA per eliminare il rischio di interferenze DNA. Questa fase è particolarmente importante nelle applicazioni a valle, come in tempo reale qRT-PCR.
- Dopo la digestione del DNA, c'è un'altra fase di lavaggio. Controllare che non tampone di lavaggio rimane nella colonna prima del trasferimento ad un altro provetta, come l'eventuale presenza del buffer nel campione finale si tradurrà in meno partenza RNA per l'amplificazione. Per garantire ciò, abbiamo centrifuga la fase finale di lavaggio per 2,5 minuti invece di 2 minuti come suggerito nel protocollo fornito.
- Infine, tampone di eluizione viene aggiunta e incubata sul filtro nella colonna per 1 minuto seguito da centrifugazione, in modo da eluire l'RNA totale.
- Pipetta 1.3ul di ciascuno dei campioni in tubi separati da 0,5 ml di eseguire un Experion HighSens LabChip. Congelare il resto del campione a -80 ° C.
Il controllo di qualità è molto importante quando isolare l'RNA, soprattutto quando la quantità è piccola e la quantità necessaria, come per gli esperimenti microarray (15μg), è grande. L'RNA estratto quindi devono essere sottoposti a controllo di qualità in vari momenti durante tutto il processo. Il primo si verifica dopo l'estrazione. Noi stabiliamo la totale integrità dell'RNA tramite esame lordo dei picchi 18S/28S del elettroferogrammi e gel virtuale generata dal Experion HighSens LabChip. Questo metodo è veloce e fornisce due mezzi di misure per controllare l'RNA di qualità, un elettroferogramma e un gel virtuale (Fig. 2). Se la qualità del RNA totale è relativamente buona (Fig.. 2A, B con C, D), abbiamo quindi procedere con amplificazione lineare dell'mRNA, che rappresenta circa il 2% del RNA totale.
5) l'amplificazione lineare:
Amplificazione di RNA estratto da laser-capture tessuti è necessario al fine di produrre un'adeguata quantità di RNA per l'ibridazione di microarray e successive qRT-PCR esperimenti. Al fine di minimizzare la possibilità di confonde potenziale preso atto con T7-based amplificazione lineare, abbiamo ridotto al minimo il numero di giri di amplificazione necessaria per massimizzare l'importo della partenza laser catturato materiali tessuti.
I nostri dati preliminari (non mostrato) suggeriscono che due turni di amplificazione lineare (RiboAmp HS PLUS kit) di RNA totale estratto da tessuti che contengono circa 500 cellule produrrebbe circa 50μg di Arna - sufficiente per lo svolgimento di entrambi i microarray e qRT-PCR esperimenti. Se possibile, evitare di trasferire inutili campione tra 0,2 ml e 0,5 ml tubi utilizzando blocchi 0,5 ml nel termociclatore e tubi di 0,5 ml fornito in kit.
Anche in questo caso, il protocollo seguito è quello fornito con il kit. Una versione abbreviata è descritto qui.
- Aggiungere 1ml del primer fornito al campione totale di RNA (circa 11μl) e incubare a 65 ° C per 5 minuti, seguita da raffreddamento a 4 ° C per 1 minuto.
- Aggiungere componenti prima parte cDNA con trascrittasi inversa SuperScript III e incubare a 42 ° C per 1 ora.
- Dopo la sintesi del secondo filamento cDNA, purificare il cDNA risultante attraverso una colonna di purificazione in dotazione. Qui si consiglia, quando il trasferimento del campione, più di buffer di legame alla colonna di purificazione, di centrifugare i tubi campione due volte - una volta dopo il trasferimento del campione alla colonna, come fino a 1ml di campione rimane sui lati dei tubi dopo il trasferimento.
- Lavare il cDNA con i tamponi di lavaggio fornito ed eluire il cDNA purificato con il buffer di eluizione.
- Aggiungere i componenti di trascrizione in vitro e incubare per 6 ore a 42 ° C.
- Dopo una fase di DNasi, purificare l'ARNA risultante con il buffer fornito, eventualmente eluizione in un totale di 12μl di tampone di eluizione.
L'RNA subisce un altro giro di amplificazione lineare (con primer a parte - vedi kit di protocollo), dopo di che più passi il controllo di qualità sono impiegati. Un ul del campione è diluito a circa 250ng/ul per determinare la lunghezza trascrizione mRNA e la concentrazione con la LabChip StdSens (Experion). Tradizionale tecnologia microarray Affymetrix richiede l'mRNA da almeno 600 nucleotidi di lunghezza per essere rilevato. Il gel e elettroferogramma ottenuto dal LabChip dovrebbe quindi rappresentare questa lunghezza minima trascrizione mRNA (Fig. 3).
Un ulteriore controllo di qualità è determinato attraverso un analisi spettrofotometro NanoDrop, dove un rapporto fatto di due densità ottica, ossia A260 e A280, determina la purezza RNA. I campioni con una densità ottica di circa 2,1 dovrebbero essere etichettati per l'analisi di espressione genica, anche se i rapporti fino a 2,7 hanno mostrato di possedere qualità comparabili ibridazione. La concentrazione deve essere tra 800ng/μl-1μg/μl, come inferiore a questo ha portato alla degradazione dell'RNA durante lo stoccaggio (anche a temperature inferiori a -80 ° C) e ha portato anche a risultati microarray poveri.
6) Biotina-etichettatura campioni di mRNA per l'analisi microarray Affymetrix:
Il TURBO kit etichettatura biotina (end-etichettatura) da Molecular Devices è usato per etichettare il ARNA ottenuti da campioni amplificati. Una versione ridotta del protocollo è data qui.
- Regolare il volume di 20 mg di ciascun campione ARNA al totale 13μl con l'aggiunta di acqua priva di nucleasi o concentrando il campione in una centrifuga a vuoto, a seconda della concentrazione iniziale. Anche se solo 15μg è necessario per il chip Affymetrix utilizzati, aggiungiamo 20μg alla reazione iniziale, come alcuni RNA è perso durante l'incubazione e centrifugazione.
- Incubare la reazione biotina a 85 ° C per 30 minuti, raffreddare e poi a 4 ° C.
- Rimuovere l'etichetta in eccesso biotina tramite centrifugazione con la colonna specializzato fornito con il kit. In alcuni casi, specialmente con mRNA degradato come quello ottenuto da FFPE (fissati in formalina, inclusi in paraffina) campioni, potrebbe essere il caso che non tutti l'mRNA viene eluita nella fase di centrifugazione singolo. Abbiamo poi consiglia di aggiungere tra 1-5μl supplementare acqua priva di nucleasi alla colonna con una fase successiva centrifugazione in più di 1 minuto. Questo assicura che la maggior parte del campione marcato è eluito.
- Il volume finale è 20μl, con una concentrazione di 1μg/μl. Se extra-acqua priva di nucleasi è stato aggiunto, si concentrano i campioni alvolume corretto con una centrifuga a vuoto. Si consiglia di mantenere la concentrazione di sperma prima di iniziare ibridazione oltre 800ng/μl, che abbiamo trovato che meno di questo porterà alla degradazione durante la conservazione e / o ibridazione con conseguente risultati microarray poveri.
ARNA è stato poi ibridato e profilo di espressione genica, mediante l'Umano X3P serie sonda GeneChip da Affymetrix. Dato che questo chip è stato progettato per più ARNA degradata, abbiamo usato come precauzione, in quanto molti fattori che non possiamo controllare può incidere sulla qualità dei tessuti post-mortem. Come il nostro laboratorio non hanno le strutture adeguate per l'ibridazione, il processo è stato eseguito presso l'impianto principale partner genomico.
Rappresentante dei risultati:
1 tessuto +2 +3) sezionamento, colorazione dei neuroni piramidali e laser-capture microdissezione:
Il protocollo di cui sopra dovrebbe portare a due diapositive con quattro sezioni per vetrino. Ogni sezione deve essere liscia con il minimo strappo, rottura e piegatura. Con colorazione corretta, la macchia identificherà neuroni piramidali colorazione scura intorno ai 20 - 25 micron di dimensione con una forma piramidale e visibile dendriti apicali. Con i tappi HS CapSure con impostazioni macro e corretta regolazione della potenza del laser e la forza per ogni sezione, si dovrebbe ottenere circa 500-700 cellule per sezione / caso che comporta almeno 500pg di RNA totale. Circa l'85 - 100% dei neuroni aderirà al tappo (Fig. 1).
4) Ottenere RNA da specifiche popolazioni di neuroni:
Come descritto, dopo la totale isolamento di RNA, controlliamo la qualità dell'RNA mediante un elettroferogramma e gel virtuale attraverso la Bio-Rad Experion. Nel elettroferogramma, dovreste vedere due picchi distinti corrispondenti alle 18S e 28S unità di RNA ribosomiale. Con il tessuto post-mortem, tuttavia, questo non è sempre così, come il tessuto può essere degradata a causa di fattori prima di sezionamento. Potrai vedere normalmente un degrado grande urto segnalare, con un picco intorno grande 18S, 28S e una più piccola di picco (Fig. 2A, B). Fino a quando i profili elettroferogramma siano comparabili tra i campioni, abbiamo trovato questa guida per ottenere una qualità di mRNA sufficiente per eseguire sia RT-PCR e microarray studi (Imbeaud et al., 2005).
Se c'è degrado troppo - come indicato da una vasta area sotto la curva del elettroferogramma, o se i picchi non sono visibili (Fig. 2C, D) - le cellule devono essere catturato di nuovo dal tessuto. Vi consigliamo di fare un tessuto-raschiare prova, in cui viene estratto l'RNA da frammenti tutta la sezione (non solo le cellule), prima di riconquistare le cellule per determinare se il blocco di tessuto è di per sé degradato.
5) l'amplificazione lineare:
Per testare la qualità del mRNA dopo due turni di amplificazione lineare, ci siamo avvalsi sia del Bio-Rad Experion StdSens LabChip e lo spettrofotometro NanoDrop. Tradizionale tecnologia microarray Affymetrix richiede l'mRNA da almeno 600 nucleotidi di lunghezza per essere rilevato, cui è stato ottenuto con questo protocollo. Infatti, le lunghezze di mRNA sono stati rilevati nel 1000-nucleotide gamma. La elettroferogramma riflette anche questo, con picchi di grandi dimensioni lentamente scendere come una funzione del tempo (Fig. 3A, B).
Le letture NanoDrop indicato una media A260/A280 rapporto di 2,5 tra campioni, indicando mRNA vitali (Tabella 2).
I nostri risultati indicano che con questo protocollo, sia la quantità e la qualità di RNA ottenuto è sufficiente per interrogare le differenze di espressione genica attraverso l'umano X3P Affymetrix GeneChip.
6) Biotina-etichettatura campioni di mRNA per l'analisi microarray Affymetrix:
Dopo ibridazione all'essere umano X3P Affymetrix GeneChip, abbiamo raggiunto chiama per cento di una media del 26,6% (Tabella 2), indicando ibridizzazione adeguata e intensità della sonda.
Tabella 1: sintesi di coorte
| Campioni | Gruppo | Sesso | Età | PMI |
| C1 | CONTROLLO | F | 79 | 15,00 |
| C2 | CONTROLLO | M | 22 | 21,47 |
| C4 | CONTROLLO | M | 75 | 20,25 |
| C5 | CONTROLLO | M | 80 | 15,50 |
| C6 | CONTROLLO | F | 58 | 21,08 |
| C8 | CONTROLLO | M | 61 | 17,00 |
| C10 | CONTROLLO | F | 71 | 20,50 |
| C11 | CONTROLLO | F | 12,66 | |
| C12 | CONTROLLO | F | 86 | 6,92 |
| MEDIA | 4M/5F | 69,11 | 16,71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6,92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21,40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21,80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22,00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17,97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10,75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17,80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21,83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13,33 |
| MEDIA | 4M/5F | 68,11 | 16,90 |
Abbreviazioni: F - femmina, M - Maschio, PMI - intervallo post-mortem, schizoph. - La schizofrenia.
Tabella 2: Sintesi dei risultati raffigurante concentrazione dell'RNA, qualità ed efficienza di ibridazione
| Campioni | [MRNA] ng / ul | A260/A280 | Sonda di intensità | Percentuale chiamata |
| C1 | 1.318,01 | 2,67 | 63 | 19,5 |
| C2 | 2.312,93 | 2,37 | 147 | 30,6 |
| C4 | 1.811,92 | 2,44 | 69 | 26,6 |
| C5 | 1.316,26 | 2,51 | 78 | 34,7 |
| C6 | 1.663,24 | 2,39 | 66 | 33,8 |
| C8 | 633,05 | 2,54 | 101 | 15,2 |
| C10 | 1326,4 | 2,47 | 92 | 32,5 |
| C11 | 994,24 | 2,75 | 76 | 22,4 |
| C12 | 817,23 | 2,7 | 56 | 15,2 |
| S1 | 2.560,88 | 2,47 | 78 | 25,0 |
| S2 | 2.169,61 | 2,43 | 76 | 26,5 |
| S3 | 2.067,32 | 2,52 | 87 | 22,1 |
| S4 | 1.563,89 | 2,75 | 82 | 28,1 |
| S5 | 2.071,44 | 2,44 | 88 | 28,2 |
| S6 | 2.532,59 | 2,34 | 72 | 30,7 |
| S8 | 2.189,22 | 2,5 | 62 | 31,8 |
| S11 | 1.669,89 | 2,47 | 41 | 27,3 |
| S12 | 1.739,35 | 2,47 | 42 | 28,0 |
| MEDIA | 1.708,75 | 2,51 | 76,44 | 26,57 |
Figura 1:. Sintesi del processo di acquisizione laser microdissezione A) neuroni piramidali sono identificati morfologicamente. B) Dopo il laser pulsato ha attraverso il film termoplastico, le cellule aderiscono al tappo e quindi non più sulla diapositiva, lasciando dietro di tessuto circostante. C) Micrografia di una popolazione di cellule omogenee aderendo sul Cap CapSure laser dopo la cattura.
Figura 2:. Controllo totale della qualità dell'RNA A + B) Rappresenta l'RNA di buona qualità dopo l'isolamento totale, mentre il C + D) illustra ciò che l'RNA totale non dovrebbe essere simile dopo l'isolamento. A) Un elettroferogramma con chiari picchi 18/28S corrispondente con il gel virtuale in (B). C) Un elettroferogramma che mostra una vasta area sotto la curva e senza picchi 18S/28S indicare la degradazione dell'RNA. Ciò è dimostrato anche nel gel virtuale (D).
Figura 3:. Controllo di qualità dell'mRNA A + B) elettroferogramma (A) e virtuale gel (B) che indica l'mRNA trascritto leng° (spread) necessari per gli studi di microarray, ad esempio estendendo ultimi 600 nucleotidi (nt). C + D) elettroferogramma (C) e virtuali gel (D), che mostra ciò che un insufficiente diffusione mRNA sarà simile, come la lunghezza trascrizione mRNA non si estende 200nt passato.
Discussion
Qui, si cerca di personalizzare un protocollo per estrarre popolazioni di cellule omogenee dal tessuto cerebrale post-mortem eterogenei utilizzando il Arcturus XT sistema e dei relativi kit di estrazione di RNA. Come accennato in precedenza, abbiamo fatto alcune modifiche ai protocolli originali forniti dalla società, al fine di massimizzare l'integrità dell'RNA. La cattura di successo di singole cellule dipende unicamente ottimizzare i passi precedenti per catturare al fine di ottenere cellule massimo con RNA bene. Questi passaggi sono i vari parametri associati con il tessuto sezionamento e colorazione. In breve, per quanto riguarda la preparazione dei tessuti queste includono: 1) diminuire il gradiente termico Durante il taglio, 2) solo ponendo 2 sezioni per vetrino, 3) esecuzione di tutte le misure disidratazione sul ghiaccio, 4) l'aggiunta di inibitore della RNasi alla macchia, 5) l'aumento la durata disidratazione in etanolo finale del 100% a 3 minuti.
Per quanto riguarda la cattura, riteniamo che la combinazione di CapSure SA cappellini, con il software di impostazione macro, dovrebbe garantire risultati ottimali. Una umidità controllata ambiente è fondamentale per catturare singole cellule, come alta umidità riduce drasticamente i tessuti "lift". Le alte temperature possono anche avere un effetto negativo sulla qualità di RNA.
Durante il protocollo di isolamento del RNA con il kit PicoPure, ci sono due fasi di lavaggio. E 'importante verificare che tutte tampone di lavaggio viene rimosso prima del trasferimento in un'altra provetta per l'eluizione di RNA, come l'eventuale presenza del buffer nel campione finale si tradurrà in meno di RNA di partenza per l'amplificazione. Per garantire ciò, abbiamo centrifuga la fase finale di lavaggio per 2,5 minuti invece di 2 minuti come suggerito nel protocollo fornito.
Per la maggior parte, il protocollo di amplificazione lineare è stato secondo le istruzioni del produttore. Tuttavia, due punti cruciali devono essere presi in considerazione quando si utilizzano questo protocollo: 1) cercare di limitare la perdita di RNA attraverso il trasferimento di eccesso di campioni tra i tubi, utilizzando solo i tubi da 0,5 ml fornito in combinazione con un blocco di 0,5 ml nel termociclatore e 2) durante il trasferimento del campione alla colonna di purificazione per la purificazione di cDNA, assicuratevi di girare giù i tubi campione dopo il primo trasferimento. Ciò si tradurrà in un ulteriore 1-2ul di esempio per aggiungere alla colonna di purificazione e quindi può aumentare il recupero di cDNA.
Se si avvalgono del TURBO fine di etichettatura kit per la biotina-etichettatura dei vostri campioni ARNA limitato, si consiglia l'aggiunta di un ulteriore pochi microlitri di acqua prima della fase di centrifugazione, per aumentare l'RNA marcato resa estratto dalla colonna. Un minuto in più di centrifugazione aiuterà anche in questo senso, soprattutto se si lavora con il tessuto degradato, come il tessuto FFPE.
Siamo certi che questo protocollo permetterà all'utente di isolare piccole strutture omogenee, come le popolazioni singola cella, all'interno del tessuto cerebrale post-mortem eterogenei. Questo riduce gli effetti di diluizione delle strutture circostanti e altri tipi di cellule situate nei vari strati all'interno del cervello, portando a risultati mirati nei confronti dei tipi cellulari specifici sotto inchiesta. Come la qualità del risultato RNA è abbastanza buona per gli studi di microarray, possiamo cominciare a individuare specifiche firme molecolari di popolazioni di cellule specifiche colpite in stati di malattia.
Disclosures
La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da Life Technologies.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine Molecular Devices tecnologie analitiche / Arturo per la loro generosa donazione di reagenti utilizzati per lo studio. Ringraziamo anche il Centro Tissue Harvard risorse per la fornitura di tessuto cerebrale umano autoptico Finanziamento:. RO1MH76060 e P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
