Denatureren Ureum polyacrylamide gel elektroforese (Urea PAGE)

Summary

Denaturerende ureum polyacrylamidegelelektroforese wordt gebruikt voor het enkelstrengs DNA gescheiden of tot RNA tot een limiet van 500 nucleotiden. Ureum in combinatie met de hitte gedenatureerd monsters en ongestructureerde enkele strengen migreren binnen de gel matrix op basis van hun moleculair gewicht.

Abstract

Ureum PAGE of denaturering ureum polyacrylamidegelelektroforese maakt gebruik van 6-8 m ureum, waar secundaire DNA of RNA-structuren gedenatureerd en wordt gebruikt voor hun scheiding in een polyacrylamide gel matrix op basis van het molecuulgewicht. Fragmenten van 2 tot 500 basen, met een lengte verschillen zo klein als een single nucleotide, kunnen worden gescheiden met behulp van deze methode ^1. De migratie van het monster is afhankelijk van de gekozen acrylamide concentratie. Een hoger percentage van polyacrylamide lost een lager molecuulgewicht fragmenten. De combinatie van ureum en temperaturen van 45-55 ° C in de gel run zorgt voor de scheiding van ongestructureerde DNA of RNA-moleculen.

In het algemeen is deze methode nodig om te analyseren of te zuiveren enkelstrengs DNA of RNA-fragmenten, zoals gesynthetiseerd of gelabelde oligonucleotiden of producten van enzymatische splitsing reacties.

In deze video artikel tonen we hoe voor te bereiden en uit te voeren de denaturering ureum polyacrylamide gels. Technische tips zijn opgenomen, in aanvulling op het oorspronkelijke protocol ^1,2.

Protocol

De volledige en gedetailleerde tekst protocol voor dit experimentele procedure is beschikbaar in Current Protocols in Molecular Biology. Gedetailleerde stap-voor-stap instructies voor de montage van de gel-sandwich en voor gel apparatuur is te vinden op de website van BioRad ^3.

Benodigde apparatuur:
Glasplaten (binnenste en buitenste)
10 cm cel: 10,1 x 7,3 cm (binnenste plaat), 10,1 x 8,2 cm (buitenste plaat), BioRad
20 cm cel: 20 x 20 cm (binnenste plaat), 20 x 22,3 cm (buitenste plaat), BioRad
0,5-1,5 mm gel kam en spacers
Gel gieten stand
Gel apparaten met deksel en kabels
Hoogspanningsvoeding
Verwarmingsblok of waterbad
Serologische pipetten en Pipette hulp
Pipet en Pipetpunten
Gel droger of een scanner

Reagentia en oplossingen:
Ureum (ultrapuur)
40% polyacrylamide-oplossing (29:1)
10 x TBE-oplossing (Tris-boraat, EDTA buffer)
Gedeïoniseerd, gedestilleerd water
TEMED
30% (w / v) ammoniumpersulfaat-oplossing
0,5 x TBE-oplossing
Formamide
EDTA
Xyleen cyanol
Broomfenolblauw
Methanol
Ethanol

Volume	50 ml			60 ml			10 ml
Acrylamide concentratie	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g ureum	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4.8	4.8	4.8
ml 40% Acryl (29:1)	12,5	15.625	18,75	15	18,75	22,5	2.5	3.125	3.75
ul 30% APS	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Vul het volume met gedeïoniseerd, gedestilleerd water

Tabel 1: reagentia en oplossingen die nodig zijn voor verschillende acrylamide concentraties en volumes voor het oplossen van enkelstrengs oligonucleotiden

Gel-sandwich montage en gel voorbereiding

1. Monteer de gel volgens fabrikanten beschrijving en bevestig de gel in de gel-casting kamer ^3. Gebruik 0,5-1,5 mm dik afstandhouders.
2. Maak de aangewezen polyacrylamide oplossing volgens de huidige protocollen in de moleculaire biologie of zoals vermeld in tabel 1. Voor een denaturerende acrylamide gel van 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml gel-oplossing en voor een 10,1 x 8,2 cm x 1 mm gel 5 ml gel-oplossing is voldoende. Grotere gels worden gebruikt als de verwachte producten / bands zich binnen het bereik van een paar bases, dan is een langere gel zal lossen bands met een verschil van een enkele nucleotide. Als de verwachte bands verschillen in meer dan 10 nucleotiden, zullen kleinere gels geschikt zijn om de fragmenten op te lossen. Kies het percentage van polyacrylamide die uw scheiding eisen voldoet, zal een hogere concentraties polyacrylamide op te lossen lager moleculair gewicht fragmenten. Gebruik ultrapure ureum en meng met de gewenste hoeveelheid acrylamide. Voeg TBE buffer om de gel mengen tot een uiteindelijke concentratie van 0,5-1 x TBE te krijgen en vullen van het volume met gedeïoniseerd, gedestilleerd water. Verwarm de oplossing gedurende 20 seconden in de magnetron en meng het. Voor grotere volumes gel herhaalt u deze stap totdat de oplossing is met de hand warm.
3. Giet de gel onmiddellijk met behulp van een serologische pipet en een automatische pipet steun tussen de twee glasplaten. Voorkomen dat er luchtbellen. Plaats de kam en laat de gel polymeriseren gedurende 30-60 minuten.

Stel de elektroforese apparatuur en prerun de gel

1. Demonteer de gel uit de casting kamer en montage aan de gel inrichting volgens instructies van de fabrikant ^3.
2. Vul de onderste buffer Kamer wit loopbuffer (0,5-1 x TBE), dat de glazen platen zal onder wordenfuseerde 2-3 cm met buffer. Vul de bovenste buffer kamer naar de top van de gel met stromend buffer.
3. Verwijder voorzichtig de kam en spoel de putten met het runnen van buffer met behulp van een pipet en het laden van gel tips.
4. Bevestig het deksel van de gel-systeem en sluit de kabels aan een hoge spanning voeding. Voordat u kunt laden uw monsters moet je de gel prerun voor ten minste 30 minuten om de gel te warmen en om de resterende ureum uit de gel. De optimale temperatuur moet tussen de 45-55 ° C. Vermijd temperaturen hoger dan 60 ° C als banden kon uitstrijkje of de glazen platen kon kraken. Kies een constante watt voor de prerun (15-25 W per gel).

Monstervoorbereiding

1. In de tussentijd de voorbereiding van uw monsters. Daarom voegt de juiste hoeveelheid van 2 x gel laden mix aan je steekproef. Het laden mix bevat meestal 90% formamide, 0,5% EDTA, 0,1% xyleen cyanol en 0,1% broomfenolblauw.
2. Voordat de monsters kunnen worden geladen op de gel moeten de monsters worden gedenatureerd warmte door verwarming van de monsters tussen de 70-90 ° C voor een paar minuten.

Laden en run de gel

1. Wanneer de prerun klaar is, verwijder het deksel en spoel de zakken goed zoals eerder beschreven als ureum is uitgeloogd in de putten.
2. Zorgvuldig toepassen van de monsters van de bodem van de zak. Voorkomen dat er luchtbellen. Laadbuffer moet worden toegepast om lege zakken om gelijke voorwaarden te houden tijdens de run.
3. Monteer het deksel en laat de gel bij constante Watt tot een gel temperatuur van 55 ° C te houden vergelijkbaar met de prerun. Let op de migratie van de marker kleurstoffen totdat de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel. De run duur is afhankelijk van het percentage van de gebruikte acrylamide, ionische sterkte van de buffer en de gel dikte. Een run kan duren tussen 2-4 uur.
   Controle van de temperatuur van de gel. Een gel thermometer kan helpen om de juiste temperatuur te controleren tijdens de run.

Verwerk de gel

1. Wanneer de kleurstof voorzijde heeft het einde van de gel bereikte de gel uit de lagere buffer kamer. Haal de gel uit de kamer en draai de klemmen. Trek de spacers en zorgvuldig huichelen de glazen platen. Indien nodig wegsnijden van de bovenste putje met gel deel.
2. Breng voorzichtig de gel in een schaal met gel fixatie oplossing (dezelfde concentratie van TBE plus 5-10% methanol en ethanol). Laat de gel in de oplossing voor 5-10 minuten en wijzigen van de buffer tweemaal.
3. De gel is klaar voor verdere verwerking met behulp van een vacuüm-gel droger of direct scannen van de gel.

Discussion

1. De band scherpte hangt af van verschillende factoren. Het volume van het monster geladen voor een scherpe bands moet zo klein mogelijk, dat wil zeggen idealiter tussen 1-5 pl. Echter, tot en met 15 ul worden geladen die nog steeds acceptabele oplossing zorgt. Minder monstervolume resulteert in scherpere bands.
2. De band kwaliteit is ook afhankelijk van de dikte van gel. Dunnere gels, zoals 0,75 mm tonen betere resultaten dan 1,5 mm dik gels.
3. De vorm van banden kunnen ook worden beïnvloed tijdens het laden van gel, als het monster is niet gelijkmatig aangebracht in de gel zak. Inclusief 10% glycerol in de laadbuffer helpt tijdens de gel het laden en het monster zinkt in de put gemakkelijker.
4. Een ander potentieel probleem dat verbonden is met het monster laadbuffer kan optreden, indien de verwachte product (en) draait op hetzelfde niveau als een van de laad-kleurstoffen. Bovendien, als fluorescente labels worden gebruikt, een aantal kleurstoffen tonen een fluorescent signaal op een soortgelijke golflengte. Als dit het geval is het verwijderen van een kleurstof of alle kleurstoffen kunnen dit probleem oplossen. Dan is het aangeraden om de kleurstof-bevattende monster uitgevoerd in een lege en een standaardmaat.
5. Lage spanning aan het begin van de run helpt ook om scherper bands, als het monster komt de gel voor soepel en het voorkomt dat de gel zakken instorten als gevolg van hoge spanning. Een korte laag percentage acrylamide stacking gel (4%) kan hebben dezelfde band-slijpen effect.
6. Een vaak ondervonden probleem is gel "lacht", die het gevolg is van ongelijke warmteverdeling door de gel tijdens de elektroforese. Als de gel wordt niet omringd door buffer, afhankelijk van welke gel-systeem wordt gebruikt, het bevestigen van een metalen plaat op de glasplaat ondersteunt een gelijke verdeling van de warmte en kan aanzienlijk te verhogen van de kwaliteit van gel.
7. Silaneren van de glazen platen voor grotere gels is aan te raden, omdat het sterk verbetert de behandeling van gels na de run, zoals gels hebben de neiging vast te houden aan de glazen platen.

Denaturerende ureum polyacrylamide gel elektroforese (ureum-PAGE) is nuttig om te analyseren of afzonderlijke enkelstrengs DNA of RNA-fragmenten, alsook radionucleotide-of fluorescent gelabelde monsters.