Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Summary

Denaturierung Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird verwendet, um Einzelstrang-DNA oder RNA getrennt bis zu einer Grenze von 500 Nukleotiden. Urea in Kombination mit Hitze denaturiert Proben und unstrukturierte Einzelstränge in der Gel-Matrix migrieren nach ihrem Molekulargewicht.

Abstract

Harnstoff-PAGE oder denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschäftigt 6-8 M Harnstoff, der sekundären DNA-oder RNA-Strukturen denaturiert und wird für die Trennung in einem Polyacrylamid-Gel-Matrix auf das Molekulargewicht eingesetzt. Fragmente zwischen 2 bis 500 Basen, mit einer Länge von Differenzen so klein wie ein single nucleotide können getrennt mit dieser Methode ¹ sein. Die Migration der Probe ist abhängig von der gewählten Acrylamid-Konzentration. Ein höherer Prozentsatz von Polyacrylamid löst niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. Die Kombination von Harnstoff und Temperaturen von 45-55 ° C während der Gel laufen zu lassen für die Trennung von unstrukturierten DNA-oder RNA-Moleküle.

Im allgemeinen wird diese Methode ist erforderlich, um zu analysieren oder zu reinigen Einzelstrang-DNA oder RNA-Fragmente, wie synthetisiert oder markierte Oligonukleotide oder Produkte aus der enzymatischen Spaltung Reaktionen.

In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie die Vorbereitung und Ausführung der denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen. Technische Tipps enthalten sind, zusätzlich zu den Original-Protokoll ^1,2.

Protocol

Die vollständige und detaillierte Text-Protokoll für dieses experimentelle Vorgehen ist in Current Protocols in Molecular Biology. Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Montage des Gels Sandwich und für Gel-Apparatur kann auf der Website BioRad ³ gefunden werden.

Erforderliche Ausrüstung:
Glasplatten (innere und äußere)
10 cm-Zelle: 10,1 x 7,3 cm (Innen-Platte), 10,1 x 8,2 cm (äußere Platte), BioRad
20 cm-Zelle: 20 x 20 cm (innere Platte), 20 x 22,3 cm (äußere Platte), BioRad
0.5-1.5 mm Gel-Kamm und Spacer
Gel Gelgießstand
Gel Gerät mit Deckel und Kabel
Hochspannungs-Netzgerät
Heizblock oder Wasserbad
Serologische Pipetten und Pipettenspitzen Hilfe
Pipette und Pipettenspitzen
Gel Trockner oder Scanner

Reagenzien und Lösungen:
Urea (Reinstwasser)
40% Polyacrylamid-Lösung (29:1)
10 x TBE-Lösung (Tris-Borat, EDTA-Puffer)
Deionisiertes, destilliertes Wasser
TEMED
30% (w / v) Ammoniumpersulfat-Lösung
0,5 x TBE-Lösung
Formamid
EDTA
Xylencyanol
Bromphenolblau
Methanol
Ethanol

Volumen	50 ml			60 ml			10 ml
Acrylamid-Konzentration	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g Harnstoff	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4,8	4,8	4,8
ml 40% Acryl (29:1)	12,5	15,625	18,75	15	18,75	22,5	2,5	3,125	3,75
ul 30% APS	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Füllen Sie das Volumen mit deionisiertem, destilliertem Wasser

Tabelle 1: Reagenzien und Lösungen für die verschiedenen Acrylamid-Konzentrationen und Volumina für die Lösung einzelner Oligonukleotide benötigt

Gel-Sandwich Montage und Gelzubereitung

1. Montieren Sie das Gel nach Herstellerangaben Beschreibung und fix das Gel in die Gel-Casting Kammer ^3. Verwenden 0,5-1,5 mm dicke Abstandshalter.
2. Die geeignete Polyacrylamid-Lösung nach aktuellen Protokolle der Molekularbiologie oder, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Für eine Denaturierung Acrylamid-Gel von 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml Gel-Lösung und für ein 10,1 x 8,2 cm x 1 mm Gel 5 ml Gel-Lösung ist ausreichend. Größere Gele verwendet werden, wenn die erwarteten Produkte / Bands im Bereich von wenigen Basen sind, dann eine längere Gel lösen Bands mit einer Differenz von einem einzigen Nukleotid. Wenn die erwarteten Banden in mehr als 10 Nukleotide unterscheiden, werden kleinere Gele geeignet sein, um die Fragmente zu lösen. Wählen Sie den Prozentsatz der Polyacrylamid, dass Ihre Trennung Anforderungen entspricht, wird eine höhere Polyacrylamid-Konzentrationen lösen niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. Verwenden Sie Reinstwasser Harnstoff und vermischen sich mit der gewünschten Menge an Acrylamid. Add TBE-Puffer, um das Gel mischen, um eine endgültige Konzentration von 0,5-1 x TBE bekommen und füllen Sie das Volumen mit deionisiertem, destilliertem Wasser. Erhitzen Sie die Lösung für 20 Sekunden in der Mikrowelle und mischen Sie es sanft. Für größere Gelvolumina wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Lösung handwarm.
3. Gießen Sie das Gel sofort mit einer serologischen Pipette und einer automatischen Pipette Hilfe zwischen den beiden Glasplatten. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Setzen Sie den Kamm und lassen Sie das Gel für 30-60 Minuten polymerisieren.

Richten Sie die Elektrophorese-Apparatur und Vorlauf des Gels

1. Demontieren Sie das Gel aus der Giesskammer und der Montage auf das Gel gemäß produziert Anleitung ^3.
2. Füllen Sie das untere Pufferkammer wit Laufpuffer (0.5-1 x TBE), dass die Glasplatten werden subzusammengeführt 2-3 cm mit Puffer. Füllen Sie die obere Pufferkammer bis an die Spitze des Gels mit Laufpuffer.
3. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und spülen Sie die Taschen mit Laufpuffer mit Hilfe einer Pipette und Ladepuffer Tipps.
4. Bringen Sie den Deckel des Gel-System und stecken Sie die Kabel zu einem Hochspannungs-Stromversorgung. Bevor Sie Ihre Proben laden können, müssen Sie das Gel für mindestens 30 Minuten Vorlauf des Gels erhitzen und die verbleibenden Harnstoff aus dem Gel zu entfernen. Die optimale Temperatur sollte zwischen 45-55 ° C. Vermeiden Sie Temperaturen über 60 ° C als Banden konnten Abstrich oder die Glasplatten knacken könnte. Wählen Sie konstante Watt für den Vorlauf (15-25 W pro Gel).

Probenvorbereitung

1. In der Zwischenzeit bereiten Sie Ihre Proben. Daher fügen Sie die entsprechende Menge von 2 x Gelbeladung Mix Ihrer Probe. Der Laden-Mix enthält in der Regel 90% Formamid, 0,5% EDTA, 0,1% Xylencyanol und 0,1% Bromphenolblau.
2. Bevor die Proben auf das Gel aufgetragen werden kann, müssen Proben werden hitzedenaturiert durch Erhitzen der Proben zwischen 70-90 ° C für ein paar Minuten.

Laden und Ausführen des Gels

1. Wenn der Vorlauf beendet ist, entfernen Sie den Deckel und spülen Sie die Taschen gründlich wie vor als Harnstoff hat sich in den Vertiefungen ausgewaschen beschrieben.
2. Übernehmen Sie die Proben vorsichtig aus dem Boden der Tasche. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Loading Puffer zu leeren Taschen angewendet werden, um gleiche Bedingungen während des Laufes zu halten.
3. Montieren Sie den Deckel, und führen Sie das Gel bei konstanten Watt zu einem Gel Temperatur von 55 ° C zu halten ähnlich dem Vorlauf. Beachten Sie die Migration der Marker-Farbstoffe, bis der Farbstoff vor Erreichen des unteren Endes des Gels. Die Laufzeit beträgt abhängig von den Prozentsatz der verwendeten Acrylamid, Ionenstärke des Puffers und Geldicke. Ein Lauf kann zwischen 2-4 Stunden dauern.
   Prüfen Sie auf die Temperatur des Gels. Ein Gel-Thermometer kann helfen, die richtige Temperatur während des Laufs zu überwachen.

Prozess des Gels

1. Wenn der Farbstoff vor das Ende des Gels erreicht Das Gel wird aus dem unteren Pufferkammer. Entfernen Sie das Gel aus der Kammer und lösen Sie die Klammern. Ziehen Sie die Abstandhalter und vorsichtig verstellen den Glasplatten. Wenn nötig entfernt der oberen und Gel Teil abgeschnitten.
2. Sorgfältig Transfer des Gels in eine Schale mit Gel Fixation Lösung (gleiche Konzentration an TBE plus 5-10% Methanol und Ethanol). Lassen Sie das Gel in die Lösung für 5-10 Minuten und ändern Sie den Puffer zweimal.
3. Das Gel ist bereit für die weitere Verarbeitung mit einem Staubsauger Geltrockner oder direktes Scannen des Gels.

Discussion

1. Die Band Schärfe hängt von mehreren Faktoren ab. Das Volumen der Probe für scharfe Banden geladen werden sollte, so klein wie möglich, also im Idealfall zwischen 1-5 pl. Allerdings können bis zu 15 ul geladen, die noch eine akzeptable Auflösung. Weniger Probenvolumen Ergebnisse in schärfere Banden.
2. Die Band Qualität ist auch abhängig von der Gel-Dicke. Thinner Gelen, wie z. B. 0,75 mm zeigen bessere Ergebnisse als 1,5 mm dicken Gele.
3. Die Form der Bänder können auch während der Gel-loading beeinflusst werden, wenn die Probe nicht in gleicher Weise in das Gel Tasche aufgetragen. Inklusive 10% Glycerin in den Ladepuffer hilft bei der Gel-Be-und der Probe sinkt in den Brunnen leichter.
4. Ein weiteres mögliches Problem, dass mit der Probe Ladepuffer verbunden ist, kann auftreten, wenn der erwartete Produkt (e) läuft auf dem gleichen Niveau als einer der Be-Farbstoffe. Außerdem, wenn fluoreszierende Etiketten verwendet werden, zeigen einige Farbstoffe ein fluoreszierendes Signal an eine ähnliche Wellenlänge. Wenn dies der Fall ist das Entfernen von einem Farbstoff oder alle Farbstoffe können dieses Problem lösen. Dann ist es ratsam, den Farbstoff-haltige Probe in eine leere und eine Größe Standard ausgeführt werden.
5. Niedrige Spannung an den Beginn des Laufs hilft auch schärfere Banden zu erhalten, wie die Probe gelangt das Gel vor reibungslos, und es wird verhindert, dass Geltaschen Zusammenbruch aufgrund der hohen Spannung. Ein kurzer geringen Prozentsatz Acrylamid Sammelgel (4%) können die gleiche Band-Schleifen-Effekt.
6. Ein häufig auftretendes Problem ist gel "smiling", die durch ungleichmäßige Wärmeverteilung durch das Gel während der Elektrophorese. Wenn das Gel nicht von Puffer umgeben, je nachdem, welche Gel-System eingesetzt wird, das Anbringen einer Metallplatte auf die Glasplatte unterstützt eine gleichmäßige Wärmeverteilung und kann wesentlich erhöhen das Gel Qualität.
7. Silanisierung der Glasplatten für größere Gele wird empfohlen, da es stark verbessert das Handling von Gelen nach dem Lauf, als Gele zum Glasplatten Verkleben neigen.

Denaturierung Harnstoff-Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea-PAGE) ist nützlich, um zu analysieren oder zwei einzelne DNA-oder RNA-Fragmente sowie Radionucleotid-oder Fluoreszenz-markierten Proben.