Summary
Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동은 단일 좌초 DNA를 분리 또는 500 세포핵의 한계까지 RNA하는 데 사용됩니다. 열 denatures 샘플 및 구조화되지 않은 단일 가닥와 함께 요소는 분자량에 따라 겔 매트릭스 내에서 마이 그 레이션.
Abstract
요소 페이지 또는 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동을 denaturing는 보조 DNA 또는 RNA의 구조를 denatures 및 분자량에 따라 polyacrylamide 젤 매트릭스에서 분리에 사용되는 6-8 M의 요소를 고용합니다. 2-500 기지 사이의 조각은 단일 염기만큼 작은 길이의 차이로이 방법 1을 사용하여 분리 수 있습니다. 샘플의 마이 그 레이션 선택한 아크릴 아미드의 농도에 따라 좌우됩니다. polyacrylamide의 높은 비율의 낮은 분자량 조각을 해결합니다. 요소와 45-55의 온도의 조합 ° C 젤 실행하는 동안 비정형 DNA 또는 RNA 분자의 분리 수 있습니다.
일반적으로이 방법은 단일 좌초된 DNA 또는 효소 절단 반응에서 합성 또는 분류 oligonucleotides 또는 제품으로 RNA 조각을 분석하거나 정화가 필요합니다.
이 비디오를 문서에서 우리는 denaturing 요소의 polyacrylamide의 젤류을 준비하고 실행하는 방법을 보여줍니다. 기술 팁은 원래 프로토콜 1,2 이외에 포함되어 있습니다.
Protocol
이 실험 절차에 대한 완전하고 상세한 텍스트 프로토콜은 분자 생물학의 현재 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 겔 샌드위치의 조립 및 겔 장치에 대한 자세한 단계별 지침은 BioRad 웹사이트 3 확인할 수 있습니다.
필수 장비 :
유리 접시 (내부 및 외부)
10cm 셀 : 10.1 X 7.3 cm (내부 판), 10.1 X 8.2 cm (외부 판), BioRad
20cm 셀 : 20 X 20cm (내부 판), 20 X 22.3 cm (외부 판), BioRad
0.5-1.5 mm 겔 빗과 스페이서
겔 주조 스탠드
덮개와 케이블로 젤 장치
고전압 전원 공급 장치
난방 장치 블록이나 물 목욕
Serological pipettes 및 피펫 에이드
피펫 및 피펫 팁
겔 건조기 스캐너
시약 및 솔루션 :
요소 (ultrapure)
40 % polyacrylamide 솔루션 (29:1)
10 × TBE 솔루션 (트리스 - Borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼)
Deionized, 증류수
TEMED
30 % (W / V) 암모늄 persulfate 솔루션
0.5 X TBE 솔루션
포름 아미드
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
크실렌 cyanol
Bromphenol 블루
메탄올
에탄올
음량 | 50 ML | 60 ML | 10 ML | ||||||
아크릴 아미드 농도 | 10% | 12.5 % | 15% | 10% | 12.5 % | 15% | 10% | 12.5 % | 15% |
g 요소 | 24 | 24 | 24 | 28.8 | 28.8 | 28.8 | 4.8 | 4.8 | 4.8 |
ML 40% 아크릴 (29:1) | 12.5 | 15.625 | 18.75 | 15 | 18.75 | 22.5 | 2.5 | 3.125 | 3.75 |
UL 30 % APS | 166 | 166 | 166 | 199.2 | 199.2 | 199.2 | 33 | 33 | 33 |
UL TEMED | 20 | 20 | 20 | 24 | 24 | 24 | 4 | 4 | 4 |
10 × TBE | 5 | 5 | 5 | 6 | 6 | 6 | 1 | 1 | 1 |
deionized, 증류수로 볼륨을 채워 |
표 1 : 단일 좌초 oligonucleotides를 해결하기위한 다양한 아크릴 아미드의 농도와 볼륨에 필요한 시약 및 솔루션
겔 샌드위치 어셈블리 및 젤 준비
- 제조 업체의 설명에 따라 겔 조립 및 겔 - 캐스팅 챔버 3 겔을 수정. 0.5-1.5 mm 두께 스페이서를 사용합니다.
- 분자 생물학의 현재 프로토콜에 따라 적절한 polyacrylamide 솔루션을 준비하거나 표 1에 나열. 20cm의 denaturing 아크릴 아미드 젤에 대한 X 22cm X 1.5 mm, 젤 솔루션 60 ML과 10.1 X 8.2 cm에 대한 X 1mm 겔 5 ML 젤 솔루션은 충분합니다. 예상 제품 / 밴드 몇 기지의 범위 내에있는 경우 큰 젤을 사용하는 다음, 더 이상 젤는 단일 염기의 차이로 밴드를 해결할 수 있습니다. 예상 밴드는 10 개 이상의 세포핵에 차이가있다면, 작은 젤은 조각을 해결하기 위해 적합한 것입니다. 귀하의 분리 요구 사항을 맞는 polyacrylamide의 비율을 선택, 높은 polyacrylamide의 농도는 낮은 분자량의 조각을 해결할 수 있습니다. 아크릴 아미드의 원하는 양의 ultrapure의 요소와 믹스를 사용합니다. 0.5-1 X TBE의 최종 농도를하고 deionized, 증류수로 볼륨을 채울 수있는 겔 믹스에 TBE 버퍼를 추가합니다. 전자렌지에 20 초 동안 솔루션을 가열하고 그것을 부드럽게 섞는다. 솔루션 손이 따뜻한 때까지 큰 겔 볼륨이 단계를 반복하십시오.
- 즉시 serological 피펫과 두 개의 유리 판 사이에 자동 피펫 에이드를 사용하여 겔 하거라. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 빗를 삽입하고 젤 30-60분을위한 중합 보자.
전기 영동 장치를 설정하고 젤 prerun
- 지침 3 제조에 따라 주조 챔버와 겔 장치에 어셈블리를에서 젤 분리합니다.
- 유리 플레이트가 서브됩니다 낮은 버퍼 챔버 재치 실행 버퍼 (0.5-1 X TBE) 작성버퍼 2~3cm을 통합. 버퍼를 실행하는 젤의 맨 위쪽 버퍼 챔버를 입력합니다.
- 조심스럽게 빗를 제거하고 도움말을 읽어 피펫 및 젤을 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어.
- 고전압 전원 공급 장치에 케이블에서 겔 시스템 및 플러그의 뚜껑을 연결합니다. 당신이 샘플을 로드할 수 있습니다 전에 젤을 가열하고 젤 남아 요소를 제거하려면 최소 30 분 동안 젤 prerun해야합니다. 최적 온도는 45-55 사이 여야합니다 ° C. 60보다 높은 온도 ° C 밴드는 얼룩이나 유리 조각이 균열있을 수 있으므로.을 피하십시오 prerun (겔 당 15-25 W)에 대한 지속적인 와트를 선택합니다.
샘플 준비
- 그 동안에 샘플을 준비합니다. 따라서, 샘플 2 X 젤 로딩 믹스의 해당 금액을 추가합니다. 로딩 혼합은 일반적으로 90 % 포름 아미드, 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 크실렌 cyanol와 0.1 % bromphenol 파란색이 포함되어 있습니다.
- 샘플이 젤에로드하기 전에 샘플을 몇 분 동안 70-90 ° C 사이의 샘플을 가열하여 열기가 변성해야합니다.
젤로드 및 실행
- prerun가 완료되면 뚜껑을 제거하고 완전히 같은 요소가 우물에 leached 것처럼 언급한 주머니를 씻어.
- 주머니 바닥에서 신중하게 샘플을 적용합니다. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 버퍼를 로딩하면 실행되는 동안 같은 상태를 유지하기 위해 빈 주머니에 적용되어야합니다.
- 뚜껑을 조립하고 55 젤 온도를 유지하기 위해 지속적인 와트에서 젤을 실행 ° C prerun과 유사합니다. 염료 앞에는 젤의 하단에 도달 때까지 마커 염료의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 운영 기간은 사용되는 아크릴 아미드의 비율, 버퍼와 겔 두께의 이온 강도에 따라 좌우됩니다. 실행 2-4시간 사이에 마지막으로하실 수 있습니다.
젤의 온도를 확인합니다. 겔 온도계가 실행되는 동안 적당한 온도를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다.
젤 공정
- 염료 앞에는 젤의 끝에 도달하면 낮은 버퍼 챔버의 겔을 넣어. 챔버에서 젤을 제거하고 클램프를 느슨하게. 스페이서 멀리 당겨 조심스럽게 유리 접시를 감추고 있기도 하죠. 필요한 잘 겔 부분을 포함하고있는 상위 버려야하는 경우.
- 조심스럽게 겔 고정 솔루션 (TBE 플러스 5-10%의 메탄올과 에탄올의 농도가 동일)와 함께 접시에 젤을 전송하기만하면됩니다. 50~10분위한 솔루션으로 젤두고 버퍼를 두 번 변경할 수 있습니다.
- 젤은 진공 겔 건조기 또는 젤 직접 스캔을 사용하여 추가 처리를위한 준비가되었습니다.
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Discussion
- 밴드 날카로움은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 선명한 밴드를위한로드 샘플의 볼륨 즉, 이상적으로 1-5 μl 사이에 가능한 작게해야합니다. 그러나, 최대 15 μl 여전히 허용 해상도를 보장하는 로드할 수 있습니다. 선명 밴드의 적은 샘플 량 결과.
- 밴드 품질 또한 겔의 두께에 따라 좌우됩니다. 같은 0.75 mm로 얇은 젤은, 1.5 mm 두께 젤보다 더 나은 결과를 보여줍니다.
- 샘플은 겔 주머니에 동일하게 적용되지 않은 경우 밴드의 모양도, 젤 로딩하는 동안 영향을받을 수 있습니다. 로딩 버퍼에 10 % 글리세롤을 포함하는 것은 물론 더 쉽게로 겔로드 및 샘플 싱크하는 동안 도움이됩니다.
- 예상 제품 (들)가 로딩 염료 중 하나와 같은 수준에서 실행하면 샘플 로딩 버퍼와 연결되어있는 또 다른 잠재적인 문제가 발생할 수 있습니다. 또한, 형광 라벨을 사용하는 경우, 일부 염료는 비슷한 파장에서 형광 신호를 보여줍니다. 이 경우 한 염료 또는 모든 염료를 제거하는 경우이 문제를 해결할 수 있습니다. 그렇다면 그것은 크기의 표준으로 빈 우물에 염료가 포함된 예제를 실행하는 것이 좋습니다.
- 샘플이 원활 젤 앞에를 입력하고 높은 전압으로 인해 해당 겔 주머니의 붕괴를 피할 수로 실행의 시작 부분에서 낮은 전압도 선명 밴드를 얻을 수 있도록 도와줍니다. 젤 스태킹 짧은 낮은 비율 아크릴 아미드 (4 %)은 동일한 대역 선명하게 영향을 미칠 수 있습니다.
- 자주 발생 문제가 젤 전기 영동 중에 젤을 통해 고르지 열 분포로 인해하는 "미소"입니다. 젤이 버퍼로 둘러싸여 있지 않다면, 유리 접시에 금속 접시의 부착, 젤 시스템이 고용하는 것은 따라 등열분포을 지원하고 실질적으로 젤 품질을 높일 수 있습니다.
- 그것이 크게 실행한 후 젤의 처리를 개선 이후 젤은 유리 접시에 집중하는 경향으로 큰 젤 유리 플레이트의 Silanizing는, 좋습니다.
Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)는 단일 좌초된 DNA 또는 RNA 조각뿐만 아니라 radionucleotide 또는 형광 - 라벨 샘플을 분석하거나 분리하는 데 유용합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 싱가포르 학술 연구위원회 (ARC) [부여 번호 90/07]에 의해 지원되었다. 우리는 지원 Radiodurans 감사합니다.
References
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. , (2001).
- PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. , Biorad. (2001).