Этот протокол описывает изоляцию и последующее расширение мезенхимальных стромальных клеток и эндотелиальных клеток, образующих колонии без использования животного сыворотку для получения аутологичных пар в экспериментальных целях трансплантации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пуповины является богатым источником для клеток-предшественников, с высокой пролиферативной потенциал в том числе мезенхимальных стромальных клеток (также называемые мезенхимальные стволовые клетки, МСК) и эндотелиальных колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs). Оба типа клеток играют ключевую роль в поддержании целостности ткани и, вероятно, также участвует в восстановительных процессов и опухолей.
Для изучения их биологии и функции в сравнительной образом, важно иметь оба типа клетки можно получить и того же донора. Он также может быть полезным для восстановительных целей для получения МСК и ECFCs из той же ткани.
Поскольку сотовая терапии в конечном счете должны найти свой путь от скамьи к постели мы создали новый метод для изоляции и дальнейшему расширению клеток-предшественников, без использования животного белка. Объединенные человека лизат тромбоцитов (pHPL) заменил эмбриональной телячьей сыворотки на всех этапах нашего протокола, чтобы полностью избежать контакта клетки ксеногенных белков.
Это видео демонстрирует методику выделения и расширение клеток-предшественников из одной пуповины.
Все материалы и процедуры будут описаны.
Протокол
Часть 1: Настройка
1. Подготовка клеточной среде культуры
Перед тем как начать подготовку среду собрать все материалы и инструменты вам понадобятся.
Оттепель 2 х 56 мл аликвоты объединенных тромбоцитов человека лизат (pHPL, самодельные: ссылка 1 и Юпитер # 1523), 10 мл 100x Пенициллин / стрептомицин решение, 2 х 5 мл L-глютамин (как Sigma).
Оттепель цитокинов и факторов роста аликвоты (VEGF, bFGF, EGF, IGF, гидрокортизон, аскорбиновая кислота, гепарин, амфотерицин предоставляется в качестве «единого quots ') с поправкой на дополняющие 1 бутылка (500 мл) EGM-2 среды (Lonza).
Из холодильника взять одну бутылку 500 мл каждая из (я) альфа-модифицированный минимальный необходимый среды (-MEM) и (II) эндотелиальной базальной среды (EBM).
Все последующие шаги выполняются в ткани ламинарным потоком капота культуры в стерильных условиях.
Подготовка без консервантов гепарина (например, Biochrom) путем растворения порошка в конечной концентрации 1000 МЕ / мл стерильной водой.
МСЦ-среда:
Используйте 500 мл-MEM, добавить 56 мл талой pHPL (см. также 1 для более подробной информации) и 2 МЕ / мл (= 224 мкл исходного раствора) консерванта без гепарина (избегает коагуляции среды, через слипания фибриногена в плазме), чтобы достичь конечной концентрации 10% pHPL. Кроме того, добавить пенициллин (100U/mL) / Стрептомицин (100μg/mL) решение и на 2 мм от L-глутамин (как Sigma).
Фильтры среды, через 20 мкм, размер пор вакуум-фильтра (Millipore). Этикетка бутылки соответствующим образом (содержание, дата).
ECFC-среда:
Используйте одну бутылку (500 мл) EBM, добавить цитокин-аликвоты, 56 мл pHPL, 10 МЕ / мл (= 1120μl запаса раствора) без консервантов гепарин, пенициллин (100U/mL) / стрептомицин (100 г / мл) раствора и 2 мм L-глутамин к базальной среды и фильтром с 20 мкл-размер пор вакуум-фильтра (Millipore). Этикетка бутылки соответствующим образом (содержание, дата).
2. Стерилизация хирургических инструментов
Пинцет, острый пара хирургических ножниц и скальпеля держатель должен быть тепло стерилизовать руды стерильных одноразовых изделий.
3. Подготовка труб для шнура коллекции
Добавить 500 МЕ консерванта - бесплатный гепарина на 50 мл полипропиленовые пробирки (Falcon) и приспосабливаться к окончательным объемом 20 мл с PBS. Передача трубы в родильном зале.
4. Информированное согласие (подтверждено вашим местным этическим комитетом или IRB).
Попросите родителей до родов, если они хотели бы пожертвовать частью мозга и адекватно информировать их о цели он будет служить.
5. Шнур пожертвование
После доставки и проверки плаценты и пуповинной отрезали 10 см кусок и сразу же перевести его на трубки заполнены с гепарином, чтобы избежать свертывания крови оставшихся внутри шнура судов. Продолжить с изолятор как можно скорее.
Часть 2: Сотовый изоляции
- Подготовка ламинарного потока культуре ткани капот путем очистки поверхностей с Incidin или 70% этанола. Место стерильной 150 см 2 клеточной культуре пластины, 75 см клеточных культур колбах (как Corning), PBS, стерилизовать хирургические инструменты, сотовые скребки, трубка держателя, 25 мл stripettes и 5 мл шприцы оснащены тупые иглы конца надлежащим образом в вашей очищены капотом.
- Предварительно обогрева подготовлены α-MEM и EGM-2 ячейки культуральной среды до 37 ° С на водяной бане.
- Принесите шнур от родильной палате в вашей лаборатории оснащены капот культуре клеток. После передачи шнур в ламинарный поток мыть дважды в PBS (путем перечисления на новые пластины), чтобы избавиться от загрязнения клеток крови. Промыть пупочную вену после canulating это с одной стороны стерильный шприц 5 мл оснащен тупой конец стрелки с PBS, пока жидкость выходит другой конец шнура становится полностью прозрачным (красноватый указывает крови загрязнения).
ECFCs:
- Подготовка 75 см 2 колбы (Corning), пометьте его и заполнить в 15-20 мл подогретого EGM-2 среды.
- Место шнура в новой пластинкой заполнена стерильной PBS.
Возьмите хирургические ножницы и перерезал пуповину на две части около 5 см в длину (короткие куски легче обрабатывать, потому что пупочных сосудов скручены вокруг своей оси). - Попробуйте найти пупочную вену (большой сосуд), вставьте одно лезвие вашего хирургических ножниц и вырезать вены продольно. На данный момент это может быть полезно, если помощник может держать уже сократила вены с двумя щипцами в то время как вы режете дальше.
- Место шнур пирогсе с разрезом вены в новой пластинкой без PBS, возьмите скребок клетки и очистить от внутренней (эндотелия) поверхности пупочной вены на срисовывать с одного конца до другого. Передача клеткам вашего подготовлены колбу путем очистки кончик скребок в среде. Повторите эту процедуру, по крайней мере 10 раз.
- Закройте флакон и положил его в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2, 95% влажности).
МСК:
- Подготовка 150 см 2 пластины культуры (Corning) и назовите его.
- Возьмите кусок шнура (после соскабливания эндотелиальных слой) и сократить весь шнур на очень мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц и стерильным скальпелем. Максимальный размер шнура части должны быть на 1-2 мм.
- Передавайте свои части шнур с стерильных щипцов в ваш предварительно помечены культуры пластины. Оставляя открытым пластине в течение 5 минут до заполнения со средой, крепление частей к пластиковой поверхности усиливается.
- Как только шнур части соединены надлежащим образом пластмассы, аккуратно добавить в 30-35 мл подогретого альфа изменение MEM. Попробуйте использовать низкие скорости, чтобы убедиться, что все фигуры остаются прикрепленными.
- Закройте пластины и поместить его в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2, 95% влажности).
Часть 3: расширение сотовых и подтверждение иммунной фенотипа с помощью проточной цитометрии
Сотовые расширения
EFCFs:
- Проверьте крепления эндотелиальных клеток на следующий день на инвертированный микроскоп и обмен целом EGM-2 средних, чтобы избавиться от всех не прилагается клеток и частиц.
- Развернуть клетки до слияния и обмена треть среду дважды в неделю. Когда слияние будет достигнуто, отделить клетки с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и передавать их на новые суда культуры. В зависимости от количества клеток в вашем T75 колбу, вы должны выбрать размер и количество новых колбы, чтобы гарантировать низкую плотность посева для дальнейшего расширения.
- Биржа треть среду два раза в неделю во время расширения клеток.
МСК:
- Следствием МСК из пуповины займет больше времени, так что вы можете ждать не менее 3-4 дней, пока вы проверить на инвертированный микроскоп для появления веретенообразных клеток в окрестностях прилагается частей ткани. При наличии достаточных ячейки вне роста, фигуры, как правило, отделить, потому что они теряют контакт с пластиком.
- Через 10-12 дней удалить ткань куски, отделить МСК из пластика с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и передавать их на новые суда культуры. В зависимости от количества ячеек в вашей тарелке вы должны решить, размер и количество новых колбы, чтобы гарантировать низкую плотность посева для дальнейшего расширения.
- Биржа треть среду два раза в неделю во время расширения клеток.
Проточная цитометрия
Необходимое оборудование:
Проточный цитометр (BD FACSCalibur), micronic труб (Corning), держателя трубки, овец сыворотке (блокирующий реагент), Eppifuge (Eppendorf), моноклональные антитела
МСК: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, изотип управления
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, изотип управления
- Дойдя до слияния, отделить клетки с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и центрифуге при 300 в течение 7 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют клетки концентрации 1х10 6 клеток / мл в PBS и модифицированный блок неспецифических антител обязательным с 10% об. / овец сыворотки в течение 20 мин при 4 ° C.
- Этикетка micronic труб и добавить соответствующие концентрации люминесцентных меченых антител.
- Добавить 50 мкл клеточной суспензии (заблокирован) в каждую пробирку и инкубировать 30 мин при 4 ° C.
- Вымойте клетки, добавив изменение PBS для удаления необязательных антител.
- Идите с вашей помечены ячейки проточного цитометра и выполнения анализа.
Часть 4: ECFC роста колоний, фиксация, окрашивание и анализа иерархий
- Семенной практически чистый собрано ECFCs при очень низкой плотности покрытия из 3 или 10 клеток на квадратный сантиметр в виде пластин клеточных культур, чтобы обеспечить единый роста колонии.
- Биржа треть среду дважды в неделю.
- После 14 дней (конец культуры) удалить среды, мыть два раза PBS и исправить колонии с ледяной решение фиксации (ацетон: Метанол = 3: 2) в течение 15 минут в холодильник.
- Отменить фиксацию решение и оставить открытыми пластинами высохнуть в течение 10 минут.
- Увлажняет клетки с дистиллированной воде в течение 10 минут.
- Добавить Харрис гематоксилин решения и пятно фиксированной колонии в течение 12 минут.
- Удалить H matoxylin раствора и промыть пластины с водопроводной водой, чтобы избавиться от оставшихся окрашивание раствора.
- Возьмите фотографии каждой колониииспользованием стереомикроскопа и импорт *. JPG или *. TIF формата файлов на вашем компьютере.
- Откройте фотографию с помощью программного обеспечения ImageJ и анализировать точный номер мобильного каждой колонии, как описано в анимации.
- Открытое программное обеспечение ImageJ и импорта колонии изображение с помощью "Файл \ Открыть" функцию в выпадающем меню.
- Приступить с помощью "Процесс \ вычитание фона» функции
- Используйте функцию '* * эллиптические или кистью отбора "в меню ImageJ отметить колонии маржи.
- Очистить окружающих образ с помощью "Правка \ Очистить Вне 'функции и обрезания изображения, выбрав пункт" Изображение \ урожая.
- Отрегулируйте порог вручную с помощью "Изображение \ Настройка \ Threshold 'функцию, таким образом, что все клетки полностью окрашены в красный цвет.
- Граф количества клеток в колонии, выбрав "Проанализировать \ Анализ частиц». Выберите соответствующие настройки (оптимизированы для каждого типа клеток) и выберите "OK". Результаты окно, в том числе клеток и новый образ, содержащий соответствующие очертания рассчитывал клетки появится.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существует множество источников, из которых, чтобы получить МСК или ECFCs в том числе костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови и т.д.
Необходимо, чтобы получить оба типа прародителей из того же источника напрямую сравнивать участия различных типов клеток в процессах, как и регенерации тканей судна или вклад в опухолевой прогрессии.
Легкость, с которой, чтобы изолировать и в дальнейшем исследовании аутологичных пар ECFCs и МСК от того же донора делает этот ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких финансовых конфликтов интересов, чтобы объявить.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Катарина Schallmoser за предоставление pHPL, Ева и Николь Роде Хофманн за полезные замечания к рукописи, Даниэла Талер и Маргарета отец hwirth для оказания технической помощи, Моника Фаррелл языковых редактирования, Уве Ланг, Маргит Хольцапфель и Сандра Eppich на кафедра акушерства за предоставление шнуры.
Эта работа была поддержана австрийским исследовательского фонда (FWF, грант N211-NAN для DS), Австрийское агентство по продвижению научных исследований (FFG, грант N200 для DS), так и взрослых стволовых клеток исследовательского фонда (AR). AR является членом программы кандидата молекулярной медицины Медицинского университета Граца.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| модифицированная среда alpha-MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-глутамин | Sigma-Aldrich | ||
| Пенициллин/Стрептомицин | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Одиночные цитокиновые наборы | Lonza Inc. | ||
| флаконы 75 cm2 | Corning | ||
| плашки 150 cm2 | Corning | ||
| Скребок для клеток | Corning | ||
| Трипсин/ЭДТА | Sigma-Aldrich | ||
| Моноклональные антитела | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| пробирки 50 ml | Falcon BD | ||
| фильтр 500 mL с размером пор 20 μm | EMD Millipore | ||
| Гепарин без консервантов | Biochrom AG |
Ссылки
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
