Summary
Этот протокол описывает изоляцию и последующее расширение мезенхимальных стромальных клеток и эндотелиальных клеток, образующих колонии без использования животного сыворотку для получения аутологичных пар в экспериментальных целях трансплантации.
Abstract
Пуповины является богатым источником для клеток-предшественников, с высокой пролиферативной потенциал в том числе мезенхимальных стромальных клеток (также называемые мезенхимальные стволовые клетки, МСК) и эндотелиальных колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs). Оба типа клеток играют ключевую роль в поддержании целостности ткани и, вероятно, также участвует в восстановительных процессов и опухолей.
Для изучения их биологии и функции в сравнительной образом, важно иметь оба типа клетки можно получить и того же донора. Он также может быть полезным для восстановительных целей для получения МСК и ECFCs из той же ткани.
Поскольку сотовая терапии в конечном счете должны найти свой путь от скамьи к постели мы создали новый метод для изоляции и дальнейшему расширению клеток-предшественников, без использования животного белка. Объединенные человека лизат тромбоцитов (pHPL) заменил эмбриональной телячьей сыворотки на всех этапах нашего протокола, чтобы полностью избежать контакта клетки ксеногенных белков.
Это видео демонстрирует методику выделения и расширение клеток-предшественников из одной пуповины.
Все материалы и процедуры будут описаны.
Protocol
Часть 1: Настройка
1. Подготовка клеточной среде культуры
Перед тем как начать подготовку среду собрать все материалы и инструменты вам понадобятся.
Оттепель 2 х 56 мл аликвоты объединенных тромбоцитов человека лизат (pHPL, самодельные: ссылка 1 и Юпитер # 1523), 10 мл 100x Пенициллин / стрептомицин решение, 2 х 5 мл L-глютамин (как Sigma).
Оттепель цитокинов и факторов роста аликвоты (VEGF, bFGF, EGF, IGF, гидрокортизон, аскорбиновая кислота, гепарин, амфотерицин предоставляется в качестве «единого quots ') с поправкой на дополняющие 1 бутылка (500 мл) EGM-2 среды (Lonza).
Из холодильника взять одну бутылку 500 мл каждая из (я) альфа-модифицированный минимальный необходимый среды (-MEM) и (II) эндотелиальной базальной среды (EBM).
Все последующие шаги выполняются в ткани ламинарным потоком капота культуры в стерильных условиях.
Подготовка без консервантов гепарина (например, Biochrom) путем растворения порошка в конечной концентрации 1000 МЕ / мл стерильной водой.
МСЦ-среда:
Используйте 500 мл-MEM, добавить 56 мл талой pHPL (см. также 1 для более подробной информации) и 2 МЕ / мл (= 224 мкл исходного раствора) консерванта без гепарина (избегает коагуляции среды, через слипания фибриногена в плазме), чтобы достичь конечной концентрации 10% pHPL. Кроме того, добавить пенициллин (100U/mL) / Стрептомицин (100μg/mL) решение и на 2 мм от L-глутамин (как Sigma).
Фильтры среды, через 20 мкм, размер пор вакуум-фильтра (Millipore). Этикетка бутылки соответствующим образом (содержание, дата).
ECFC-среда:
Используйте одну бутылку (500 мл) EBM, добавить цитокин-аликвоты, 56 мл pHPL, 10 МЕ / мл (= 1120μl запаса раствора) без консервантов гепарин, пенициллин (100U/mL) / стрептомицин (100 г / мл) раствора и 2 мм L-глутамин к базальной среды и фильтром с 20 мкл-размер пор вакуум-фильтра (Millipore). Этикетка бутылки соответствующим образом (содержание, дата).
2. Стерилизация хирургических инструментов
Пинцет, острый пара хирургических ножниц и скальпеля держатель должен быть тепло стерилизовать руды стерильных одноразовых изделий.
3. Подготовка труб для шнура коллекции
Добавить 500 МЕ консерванта - бесплатный гепарина на 50 мл полипропиленовые пробирки (Falcon) и приспосабливаться к окончательным объемом 20 мл с PBS. Передача трубы в родильном зале.
4. Информированное согласие (подтверждено вашим местным этическим комитетом или IRB).
Попросите родителей до родов, если они хотели бы пожертвовать частью мозга и адекватно информировать их о цели он будет служить.
5. Шнур пожертвование
После доставки и проверки плаценты и пуповинной отрезали 10 см кусок и сразу же перевести его на трубки заполнены с гепарином, чтобы избежать свертывания крови оставшихся внутри шнура судов. Продолжить с изолятор как можно скорее.
Часть 2: Сотовый изоляции
- Подготовка ламинарного потока культуре ткани капот путем очистки поверхностей с Incidin или 70% этанола. Место стерильной 150 см 2 клеточной культуре пластины, 75 см клеточных культур колбах (как Corning), PBS, стерилизовать хирургические инструменты, сотовые скребки, трубка держателя, 25 мл stripettes и 5 мл шприцы оснащены тупые иглы конца надлежащим образом в вашей очищены капотом.
- Предварительно обогрева подготовлены α-MEM и EGM-2 ячейки культуральной среды до 37 ° С на водяной бане.
- Принесите шнур от родильной палате в вашей лаборатории оснащены капот культуре клеток. После передачи шнур в ламинарный поток мыть дважды в PBS (путем перечисления на новые пластины), чтобы избавиться от загрязнения клеток крови. Промыть пупочную вену после canulating это с одной стороны стерильный шприц 5 мл оснащен тупой конец стрелки с PBS, пока жидкость выходит другой конец шнура становится полностью прозрачным (красноватый указывает крови загрязнения).
ECFCs:
- Подготовка 75 см 2 колбы (Corning), пометьте его и заполнить в 15-20 мл подогретого EGM-2 среды.
- Место шнура в новой пластинкой заполнена стерильной PBS.
Возьмите хирургические ножницы и перерезал пуповину на две части около 5 см в длину (короткие куски легче обрабатывать, потому что пупочных сосудов скручены вокруг своей оси). - Попробуйте найти пупочную вену (большой сосуд), вставьте одно лезвие вашего хирургических ножниц и вырезать вены продольно. На данный момент это может быть полезно, если помощник может держать уже сократила вены с двумя щипцами в то время как вы режете дальше.
- Место шнур пирогсе с разрезом вены в новой пластинкой без PBS, возьмите скребок клетки и очистить от внутренней (эндотелия) поверхности пупочной вены на срисовывать с одного конца до другого. Передача клеткам вашего подготовлены колбу путем очистки кончик скребок в среде. Повторите эту процедуру, по крайней мере 10 раз.
- Закройте флакон и положил его в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2, 95% влажности).
МСК:
- Подготовка 150 см 2 пластины культуры (Corning) и назовите его.
- Возьмите кусок шнура (после соскабливания эндотелиальных слой) и сократить весь шнур на очень мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц и стерильным скальпелем. Максимальный размер шнура части должны быть на 1-2 мм.
- Передавайте свои части шнур с стерильных щипцов в ваш предварительно помечены культуры пластины. Оставляя открытым пластине в течение 5 минут до заполнения со средой, крепление частей к пластиковой поверхности усиливается.
- Как только шнур части соединены надлежащим образом пластмассы, аккуратно добавить в 30-35 мл подогретого альфа изменение MEM. Попробуйте использовать низкие скорости, чтобы убедиться, что все фигуры остаются прикрепленными.
- Закройте пластины и поместить его в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2, 95% влажности).
Часть 3: расширение сотовых и подтверждение иммунной фенотипа с помощью проточной цитометрии
Сотовые расширения
EFCFs:
- Проверьте крепления эндотелиальных клеток на следующий день на инвертированный микроскоп и обмен целом EGM-2 средних, чтобы избавиться от всех не прилагается клеток и частиц.
- Развернуть клетки до слияния и обмена треть среду дважды в неделю. Когда слияние будет достигнуто, отделить клетки с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и передавать их на новые суда культуры. В зависимости от количества клеток в вашем T75 колбу, вы должны выбрать размер и количество новых колбы, чтобы гарантировать низкую плотность посева для дальнейшего расширения.
- Биржа треть среду два раза в неделю во время расширения клеток.
МСК:
- Следствием МСК из пуповины займет больше времени, так что вы можете ждать не менее 3-4 дней, пока вы проверить на инвертированный микроскоп для появления веретенообразных клеток в окрестностях прилагается частей ткани. При наличии достаточных ячейки вне роста, фигуры, как правило, отделить, потому что они теряют контакт с пластиком.
- Через 10-12 дней удалить ткань куски, отделить МСК из пластика с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и передавать их на новые суда культуры. В зависимости от количества ячеек в вашей тарелке вы должны решить, размер и количество новых колбы, чтобы гарантировать низкую плотность посева для дальнейшего расширения.
- Биржа треть среду два раза в неделю во время расширения клеток.
Проточная цитометрия
Необходимое оборудование:
Проточный цитометр (BD FACSCalibur), micronic труб (Corning), держателя трубки, овец сыворотке (блокирующий реагент), Eppifuge (Eppendorf), моноклональные антитела
МСК: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, изотип управления
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, изотип управления
- Дойдя до слияния, отделить клетки с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и центрифуге при 300 в течение 7 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют клетки концентрации 1х10 6 клеток / мл в PBS и модифицированный блок неспецифических антител обязательным с 10% об. / овец сыворотки в течение 20 мин при 4 ° C.
- Этикетка micronic труб и добавить соответствующие концентрации люминесцентных меченых антител.
- Добавить 50 мкл клеточной суспензии (заблокирован) в каждую пробирку и инкубировать 30 мин при 4 ° C.
- Вымойте клетки, добавив изменение PBS для удаления необязательных антител.
- Идите с вашей помечены ячейки проточного цитометра и выполнения анализа.
Часть 4: ECFC роста колоний, фиксация, окрашивание и анализа иерархий
- Семенной практически чистый собрано ECFCs при очень низкой плотности покрытия из 3 или 10 клеток на квадратный сантиметр в виде пластин клеточных культур, чтобы обеспечить единый роста колонии.
- Биржа треть среду дважды в неделю.
- После 14 дней (конец культуры) удалить среды, мыть два раза PBS и исправить колонии с ледяной решение фиксации (ацетон: Метанол = 3: 2) в течение 15 минут в холодильник.
- Отменить фиксацию решение и оставить открытыми пластинами высохнуть в течение 10 минут.
- Увлажняет клетки с дистиллированной воде в течение 10 минут.
- Добавить Харрис гематоксилин решения и пятно фиксированной колонии в течение 12 минут.
- Удалить H matoxylin раствора и промыть пластины с водопроводной водой, чтобы избавиться от оставшихся окрашивание раствора.
- Возьмите фотографии каждой колониииспользованием стереомикроскопа и импорт *. JPG или *. TIF формата файлов на вашем компьютере.
- Откройте фотографию с помощью программного обеспечения ImageJ и анализировать точный номер мобильного каждой колонии, как описано в анимации.
- Открытое программное обеспечение ImageJ и импорта колонии изображение с помощью "Файл \ Открыть" функцию в выпадающем меню.
- Приступить с помощью "Процесс \ вычитание фона» функции
- Используйте функцию '* * эллиптические или кистью отбора "в меню ImageJ отметить колонии маржи.
- Очистить окружающих образ с помощью "Правка \ Очистить Вне 'функции и обрезания изображения, выбрав пункт" Изображение \ урожая.
- Отрегулируйте порог вручную с помощью "Изображение \ Настройка \ Threshold 'функцию, таким образом, что все клетки полностью окрашены в красный цвет.
- Граф количества клеток в колонии, выбрав "Проанализировать \ Анализ частиц». Выберите соответствующие настройки (оптимизированы для каждого типа клеток) и выберите "OK". Результаты окно, в том числе клеток и новый образ, содержащий соответствующие очертания рассчитывал клетки появится.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует множество источников, из которых, чтобы получить МСК или ECFCs в том числе костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови и т.д.
Необходимо, чтобы получить оба типа прародителей из того же источника напрямую сравнивать участия различных типов клеток в процессах, как и регенерации тканей судна или вклад в опухолевой прогрессии.
Легкость, с которой, чтобы изолировать и в дальнейшем исследовании аутологичных пар ECFCs и МСК от того же донора делает этот метод выгодно для исключения доноров вариации в рамках отдельных экспериментов.
Возможные загрязнения гемопоэтических клеток минимизировать путем пассажей шаг и подтверждены проточной цитометрии.
Если все сделано правильно, изолированных клеток должны (я) имеют особенности клеток-предшественников, (II) будут доступны для экспериментальной пересадки в достаточном количестве, и (III), быть чистым, что подтверждается с помощью проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких финансовых конфликтов интересов, чтобы объявить.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Катарина Schallmoser за предоставление pHPL, Ева и Николь Роде Хофманн за полезные замечания к рукописи, Даниэла Талер и Маргарета отец hwirth для оказания технической помощи, Моника Фаррелл языковых редактирования, Уве Ланг, Маргит Хольцапфель и Сандра Eppich на кафедра акушерства за предоставление шнуры.
Эта работа была поддержана австрийским исследовательского фонда (FWF, грант N211-NAN для DS), Австрийское агентство по продвижению научных исследований (FFG, грант N200 для DS), так и взрослых стволовых клеток исследовательского фонда (AR). AR является членом программы кандидата молекулярной медицины Медицинского университета Граца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
