Summary
이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.
Abstract
탯줄은 mesenchymal stromal 세포 (또한 칭했다 mesenchymal 줄기 세포, MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)를 포함하여 높은 proliferative 가능성 전구 세포에 대한 풍부한 소스입니다. 두 세포 유형은 조직의 무결성을 유지하는 핵심 선수이며, 아마도 이것도 재생 프로세스와 종양 형성에 관여하고 있습니다.
비교 방식으로 자신의 생물학과 기능을 연구하기 위해이 같은 기증자에서 사용할 수 두 세포 유형을 가지고하는 것이 중요합니다. 또한 같은 조직에서 MSCS와 ECFCs를 추출 재생 목적을 위해 도움이 될 수 있습니다.
세포 치료제 결국 벤치에서 병상 그들의 방법을 발견해야하기 때문에 우리가 분리하는 새로운 방법을 설립하여 추가로 동물 단백질을 사용하지 않고 전구 세포를 확장합니다. 풀링 인간의 혈소판의 lysate (pHPL)는 완전히 xenogeneic 단백질로 세포의 접촉을 방지하기 위해 프로토콜의 모든 단계에서 태아 소 혈청을 대체.
이 동영상은 하나의 탯줄에서 전구 세포의 분리 및 확장을위한 방법을 보여줍니다.
모든 자료와 절차가 설명됩니다.
Protocol
1 부 : 설정
1. 세포 배양 매체의 준비
매체 준비를 시작하기 전에 모든 자료 및 필요한 도구를 수집합니다.
해동이 풀링 인간의 혈소판 lysate의 X 56 ML aliquots (pHPL, 자수 성 가한 : 참조 1 & 조브 # 1523), 100x 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션, 2의 10 ML L - 글루타민의 X 5 ML (시그마 모두).
EGM - 2 중간 (Lonza) 1 병 (500 ML)를 보완을위한 조정 시토킨과 성장 인자의 aliquots을 (VEGF, bFGF, EGF, IGF 하이드로코티손, Amphotericin는 '단일 quots'로 제공 아스코르비 산, 헤파린) 해동.
냉장고 한 500 ML 병 각 (I) 최소한의 필수적인 매체 알파 - 수정 (A - 멤)과 (ii) 본 내피 기초 매체 (EBM)을 가져가라.
다음 단계의 모든 무균 조건 하에서 층류 조직 문화 후드에서 수행됩니다.
멸균 물 1,000 IU / ML의 최종 농도에 분말을 분해하여 방부제없는 헤파린 (예, Biochrom) 준비.
MSC - 중간 :
A - 멤 500 ML을 사용하여 해동 pHPL 56 ML (또한 자세한 내용은 1 참조 참조) 2 IU / ML (재고 솔루션의 μl = 224) 방부제없는 헤파린의을 (의 clumping을 통해 매체의 응고를 방지 추가 플라즈마에있는 섬유소)는 10 % pHPL의 최종 농도에 도달합니다. 또한 페니실린 (100U/mL) / 스트렙토 마이신 (100μg/mL) 솔루션과 L - Glutamin의 2mM을 (시그마 모두) 추가합니다.
20 μm의 기공 크기 - 진공 필터 (Millipore)을 통해 매체를 필터링합니다. (내용, 날짜) 적절하게 병을 라벨.
ECFC - 중간 :
시토킨 - aliquots, 방부제없는 헤파린의 pHPL, 10 IU / ML (재고 솔루션 = 1120μl) 56 ML 페니실린 (100U/mL) / 스트렙토 마이신 (100 추가 EBM 한 병 (500 ML)를 사용하여 G / ML) 솔루션과 20 μl - 기공 크기의 진공 필터 (Millipore)와 기저 매체와 필터 L - Glutamin의 2mM. (내용, 날짜) 적절하게 병을 라벨.
2. 수술 악기 살균
집게, 가위와 메스 수술 자의 날카로운 한 쌍의 열이 소독 살균 광석 disposables해야합니다.
3. 코드 수집 튜브의 준비
50 ML의 폴리 프로필렌 튜브 (팔콘) 무료로 헤파린과 PBS 20 ML의 최종 볼륨 조정 - 방부제 500 IU를 추가합니다. 배달 방에 튜브를 전송합니다.
4. 정보 동의 (해당 지역 윤리위원회 또는 IRB에서 확인).
그들은 코드의 조각을 기부하고 적절하게 그것이 될 것입니다 목적을 알려하려는 경우 이전에 배달하는 부모에게 물어보십시오.
5. 코드 기증
태반과 탯줄의 전달 및 검사는 10cm의 조각을 잘라 즉시 코드 혈관 내부에 남아있는 혈액의 응고를 방지하기 위해 헤파린과 prefilled하여 튜브로 전송 후. 가능한 한 빨리 세포 격리으로 계속합니다.
2 부 : 휴대 절연
- Incidin 또는 70 % EtOH로 표면을 청소하여 층류 조직 문화 후드를 준비합니다. 플레이스 무균 150cm 2 세포 배양 접시, 75cm의 세포 배양 flasks (코닝 모두), PBS는 수술기구, 세포기구, 튜브 홀더, 25 ML stripettes 및 청소 모자에 적절하게 뭉툭한 끝 바늘을 갖춘 5 ML 주사기를 소독.
- 사전 따뜻한 당신의 준비 α - 멤 및 EGM - 2 37 세포 배양 매체 ° C 물 목욕 인치
- 출산 실에서 세포 배양 후드가 장착된 귀하의 연구실에 코드를 가져와. 층류 흐름에 코드를 전송 후 혈액 세포를 오염 제거하는 (새 접시에 전송하여) PBS로 두 번 씻는다. 코드의 다른 쪽 끝을 나오는 액체까지 PBS와 뭉툭한 끝을 바늘을 갖춘 무균 5mL 주사기로 한쪽에 canulating 후 제대 정맥 린스하면 (붉은 혈액 오염을 나타냅니다) 완전히 투명하게됩니다.
ECFCs :
- 75cm 2 플라스크 (코닝)를 준비, 그것을 분류하고 미리 예열 EGM - 2 매체의 15-20 ML 입력합니다.
- 멸균 PBS로 가득 새 접시에 코드를 삽입합니다.
외과 가위를 가지고 길이 약 5cm의 두 조각 (제대 혈관이 자신의 축을 따라 꼬여 있기 때문에 짧은 조각은 프로세스에 쉽게)에 탯줄을 잘라. - 배꼽 정맥 (대형 선박)을 찾으려고 당신의 외과 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 길이 방향 정맥을 잘라. 당신이 더 컷 동안 조수 두 집게로 이미 절단 정맥을 보유할 수있다면이 시점에서 그것은 도움이 될 수 있습니다.
- 코드 파이 플레이스CE는 PBS없이 새 접시에 자른 정맥과 세포 스크레이퍼 한 끝에서 다른 rubbings하여 제대 정맥의 내부 (내피) 표면의 다쳤어요 가져가라. 매체에 스크레이퍼의 팁을 청소하여 준비 플라스크에 세포를 전송합니다. 이 절차를 적어도 10 번 반복합니다.
- 당신의 휴대용 술병을 닫고에 넣어 배양기 (37 ° C 5 % CO 2, 95 % 습도).
MSCS :
- 150cm 두 문화 플레이트 (코닝)을 준비하고 레이블을 붙입니다.
- 코드의 조각을 (내피 층을 근근이 살아가고 이후) 타고 살균 및 멸균 메스 가위를 사용하여 매우 작은 조각으로 전체 코드를 잘라. 코드 조각의 최대 크기는 1~2mm해야합니다.
- 예약 표시 문화 판에 멸균 포셉하여 코드 조각을 전송합니다. 판 중간 차오르고 전에 5 분 동안 열어두고으로 플라스틱 표면에 조각의 첨부 파일이 강화됩니다.
- 코드 조각은 플라스틱에 적절하게 연결되면, 부드럽게 멤으로 바뀌었 사전 예열 알파의 30-35 ML에 추가합니다. 모든 조각이 붙어 남아 있는지 확인하기 위해 낮은 속도를 사용해 봅니다.
- 접시를 닫고에 넣어 배양기 (37 ° C 5 % CO 2, 95 % 습도).
파트 3 : 셀 확장 및 유동세포계측법에 의해 면역 - 표현형의 확인
셀 확장
EFCFs :
- 거꾸로 현미경 및 교환에 대한 내피 세포의 부착 다음날 체크 전체 EGM - 2 이외의 모든 연결된 세포 및 입자 제거하는 매체.
- 매체의 합류와 교환 삼분의 일 일주일에 두 번 때까지 전지를 확장합니다. 합류에 도달하면, 0.05 % Trypsin/0.7 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 세포를 분리하고 새로운 문화 선박에게 전송할 수 있습니다. 귀하의 T75 플라스크 내에서 세포의 숫자에 따라 추가 확장을위한 낮은 시딩 밀도를 보장하는 새로운 flasks의 크기와 숫자를 선택해야합니다.
- 세포의 확장하는 동안 중간 일주일에 두 번 교환 삼분의 일.
MSCS :
- 코드에서 MSCS의 가지는 많은 시간이 걸릴 것입니다, 그래서 당신은 첨부된 조직 조각의 주변에서 스핀들 모양의 세포의 모양에 대해 거꾸로 현미경을 확인까지 적어도 3~4일 기다릴 수 있습니다. 충분한 세포 밖으로 성장이 때, 조각들은 플라스틱과 접촉을 잃고 있기 때문에 분리하는 경향이있다.
- 10-12일이 조직 조각을 제거한 후 0.05 % Trypsin/0.7 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 플라스틱에서 MSCS를 분리하고 새로운 문화 선박에게 전송할 수 있습니다. 당신이 더 확장을 위해 낮은 시딩 밀도를 보장하는 새로운 flasks의 크기와 수를 결정해야합니다 접시 내에서 세포의 크기에 따라 다릅니다.
- 세포의 확장하는 동안 중간 일주일에 두 번 교환 삼분의 일.
유동세포계측법
장비 필요 :
흐름 cytometer (BD FACSCalibur), micronic 튜브 (코닝), 튜브 홀더, 양 혈청 (시약을 차단), Eppifuge (Eppendorf), 단클론 항체
MSCS : CD45, CD14, CD19, HLA - DR, CD31, CD73, CD90, CD105, isotype 컨트롤
ECFCs : CD45, CD14, CD19, HLA - DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, isotype 컨트롤
- 합류에 도달 후, 4 7 분 300g에 0.05 % Trypsin/0.7 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 원심 분리기로 세포를 분리 ° C.
- 수정 PBS 10 % 4 20 분 V / V 양 혈청 ° C.와 블록 unspecific 항체 바인딩에 1x10 6 셀 / ML의 농도로 세포를 Resuspend
- micronic 튜브를 라벨 및 라벨 형광 항체의 적절한 농도를 추가합니다.
- 각각의 튜브에 세포 현탁액 (차단) 50 μl를 추가하고 4 30 분 품어 ° C.
- 구속력 항체를 제거하기 위해 수정 PBS를 추가하여 세포를 씻으십시오.
- 흐름 cytometer에 표시된 세포로 이동하여 분석을 수행합니다.
4 부 : ECFC 식민지의 성장, 고정, 얼룩 및 계층 분석
- 종자 세포 배양 접시에 cm2 당 3 또는 10 세포의 매우 낮은 도금 밀도에 거의 순수 수확 ECFCs 단일 콜로니 성장 수 있습니다.
- 매체 일주일에 두 번 교환 삼분의 일.
- 십사일은 (문화의 끝) 매체를 제거한 후 PBS로 두 번 씻어 얼음 차가운 고정 솔루션 (아세톤 2 : 메탄올 = 3)으로 식민지를 수정 냉장고에 15 분.
- 고정 솔루션을 버리고 접시 10 분 동안 건조 열어두고.
- 10 분 증류수로 세포 Rehydrate.
- 해리스 Hematoxylin 솔루션을 추가 12 분 동안 고정 식민지를 얼룩.
- H matoxylin 솔루션을 제거하고 남은 얼룩 솔루션 없애 수돗물로 씻어 접시.
- 각 식민지의 사진을 찍어stereomicroscope 및 가져오기를 사용하여 *. JPG 또는 귀하의 컴퓨터에 *. TIF 형식의 파일을.
- ImageJ 소프트웨어로 사진을 열고 애니메이션에서 설명한대로 각 식민지의 정확한 휴대폰 번호를 분석합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 열고 풀다운 메뉴에서 '파일 \ 열기'기능을 사용하여 식민지 이미지를 가져옵니다.
- 함수 '\ 빼기 배경 프로세스'를 사용하여 진행
- 식민지의 마진을 표시 ImageJ 메뉴에서 '* * 또는 타원형 브러쉬 선택'기능을 사용하십시오.
- '편집 \ 밖에는'기능과 자르기 '\ 자르기 이미지'를 선택하여 사진을 사용하여 주변 이미지를 지웁니다.
- 사용하여 수동으로 임계값을 조정 '이미지 \ \ 임계값 조정'모든 세포가 완전히 붉은 색 있도록 기능을.
- '분석 \ 분석 입자'를 선택하여 식민지의 휴대폰 번호를 계산합니다. 적절한 설정 (각 세포 유형에 대한 최적화)를 선택하고 '확인'을 선택합니다. 셀 계산 및 계산 세포의 해당 윤곽선을 포함하는 새로운 이미지를 포함한 결과 상자가 나타납니다.
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Discussion
골수, 지방 조직, 코드 혈액 등 MSCS 또는 ECFCs를 얻을 수있는 소스에서 다양한있다
그것은 동일한 소스에서 progenitors 두 가지 유형의 직접 조직과 혈관 재생 또는 종양 진행에 기여와 같은 프로세스에서 다른 세포 유형의 개입을 비교 얻을 필요합니다.
분리하고 이후 같은 기증자로부터 ECFCs 및 MSCS의 autologous 쌍을 공부하는 데 쉽게 개별 실험 이내에 기증자의 변형을 제외한이 방법이 유리합니다.
조혈 세포와 오염 가능성이 passaging 단계를 통해 최소화하고 유동세포계측법로 확인됩니다.
제대로하면, 고립된 세포는 (i) 전구 세포의 주 기능을하고, (ii) 충분한 금액 실험 이식 가능해야하며 유동세포계측법에 의해 확인 등 (3) 순수합니다.
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Disclosures
저자는 선언에 관심의 금융 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 원고에게 유용한 의견, 다니엘라 탈러 및 Margaretha 천 hwirth 기술 지원, 언어 편집을위한 모니카 패럴, UWE 랑, 마짓 Holzapfel 및 산과학학과에서 산드라 Eppich에 대한 pHPL, 에바 Rohde과 니콜 호프만를 제공 Katharina Schallmoser 감사 코드를 제공.
이 작품은 오스트리아 연구 재단 (FWF, DS 부여 N211 - 할머니), 오스트리아 연구 진흥 공사 (FFG, DS 부여 N200)와 성인 줄기 세포 연구 재단 (AR)에 의해 지원되었습니다. AR는 그라츠의 의과 대학의 박사 과정 분자 의학의 동료입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
