Summary
इस प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण के प्रयोजनों के लिए ऑटोलॉगस जोड़े उत्पन्न सीरम जानवर के उपयोग के बिना mesenchymal stromal कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं कॉलोनी के गठन के बाद विस्तार अलगाव का वर्णन करता है.
Abstract
गर्भनाल उच्च mesenchymal stromal कोशिकाओं (यह भी कहा mesenchymal स्टेम सेल, MSCs) और endothelial कॉलोनी बनाने के पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (ECFCs) सहित proliferative संभावित पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए एक समृद्ध स्रोत है. दोनों प्रकार की कोशिकाओं ऊतक की अखंडता को बनाए रखने में प्रमुख खिलाड़ी रहे हैं और शायद पुनर्योजी प्रक्रियाओं और ट्यूमर गठन में भी शामिल है.
उनके और एक तुलनात्मक ढंग से जीव विज्ञान समारोह का अध्ययन करने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि दोनों कक्षों प्रकार एक ही दाता से उपलब्ध है. यह भी पुनर्योजी प्रयोजनों के लिए फायदेमंद हो सकता है एक ही ऊतक से MSCs और ECFCs प्राप्त हो सकता है.
क्योंकि सेलुलर चिकित्सा अंततः बेंच से bedside करने के लिए अपने रास्ते का पता लगाना चाहिए कि हम एक नई विधि के लिए अलग स्थापना की और आगे पशु प्रोटीन के उपयोग के बिना पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का विस्तार. जमा मानव प्लेटलेट lysate (pHPL) हमारे प्रोटोकॉल के सभी चरणों में भ्रूण गोजातीय सीरम की जगह पूरी तरह से xenogeneic प्रोटीन कोशिकाओं के संपर्क से बचने के.
यह वीडियो एक गर्भनाल से पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अलगाव और विस्तार के लिए एक पद्धति को दर्शाता है.
सभी सामग्री और प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाएगा.
Protocol
भाग 1: स्थापना
1. सेल संस्कृति माध्यम की तैयारी
मध्यम तैयारी शुरू करने से पहले सभी सामग्री और उपकरण आप की आवश्यकता होगी इकट्ठा.
2 पिघलना एक्स जमा मानव प्लेटलेट lysate के 56 मिलीलीटर aliquots (pHPL, स्वयं बनाया: 1 संदर्भ और 1523 # जौव), 100x पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 2 के 10 मिलीलीटर एक्स एल Glutamine 5 एमएल (दोनों सिग्मा).
Cytokine और वृद्धि कारक aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hydrocortisone, ascorbic एसिड, हेपरिन, Amphotericin 'एकल quots' के रूप में प्रदान) ईजीएम-2 मध्यम (Lonza) की 1 बोतल (500 एमएल) का सप्लीमेंट के लिए समायोजित पहले गला लें.
फ्रिज में से एक 500 मिलीलीटर की बोतल के प्रत्येक (i) न्यूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा संशोधित (एक सदस्य) और (ii) endothelial बेसल मध्यम (EBM) ले लो.
निम्न चरणों के सभी एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.
1000 / बाँझ पानी के साथ आइयू एमएल के एक अंतिम एकाग्रता पाउडर भंग द्वारा परिरक्षक मुक्त हेपरिन (उदाहरण के लिए, Biochrom) तैयार करें.
एमएससी - मध्यम:
एक सदस्य के 500 एमएल का प्रयोग करें, thawed pHPL के 56 एमएल (देखें भी अधिक जानकारी के लिए एक संदर्भ) और 2 आइयू / एमएल (= शेयर समाधान के μl 224) (के clumping के माध्यम से मध्यम की जमावट से बचा जाता परिरक्षक मुक्त हेपरिन के जोड़ प्लाज्मा में फाइब्रिनोजेन) 10% pHPL की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. इसके अतिरिक्त पेनिसिलिन (100U/mL) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100μg/mL) समाधान और एल Glutamin के 2mm (दोनों सिग्मा) जोड़ें.
एक 20 सुक्ष्ममापी ताकना आकार वैक्यूम फिल्टर (Millipore) के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर. बोतल उचित लेबल (सामग्री, तिथि,).
ECFC - मध्यम:
EBM (500 एमएल) की एक बोतल का उपयोग करें, साइटोकाइन aliquots, परिरक्षक मुक्त हेपरिन की 56 एमएल pHPL, 10 आइयू / एमएल (= 1120μl शेयर समाधान के), (100U/mL) पेनिसिलीन / (स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 जोड़ने के छ / एमएल) समाधान और एल Glutamin के बेसल और मध्यम फिल्टर करने के लिए एक 20 μl ध्यान में लीन होना आकार वैक्यूम फिल्टर (Millipore) के साथ 2mm. बोतल उचित लेबल (सामग्री, तिथि,).
2. शल्य चिकित्सा उपकरणों का बंध्याकरण
संदंश, शल्य कैंची और स्केलपेल धारक के तेज जोड़ी गर्मी निष्फल अयस्क disposables बाँझ होना चाहिए.
3. ट्यूबों के गर्भनाल संग्रह के लिए तैयार
50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब (फाल्कन) मुफ्त हेपरिन और पीबीएस के साथ 20 एमएल के अंतिम मात्रा को समायोजित करने के लिए संरक्षक के 500 आइयू जोड़ें. प्रसव के कमरे में ट्यूबों का स्थानांतरण.
4. सूचित सहमति (अपने स्थानीय नैतिक समिति या आईआरबी द्वारा पुष्टि).
प्रसव के लिए पहले से पूछो माता पिता अगर वे करने के लिए रस्सी का एक टुकड़ा दान और पर्याप्त रूप से उन प्रयोजनों की सेवा करेंगे के बारे में सूचित करना चाहते हैं.
5. गर्भनाल दान
बाद डिलीवरी और नाल और गर्भनाल के निरीक्षण से एक 10 सेमी टुकड़ा काट और इसे तुरंत अपने हेपरिन साथ प्रीफिल्ड कॉर्ड वाहिकाओं के अंदर शेष रक्त की जमावट से बचने के ट्यूब को हस्तांतरण. सेल अलगाव के साथ जारी रखें पर जितनी जल्दी हो सके.
भाग 2: सेल अलगाव
- लामिना का प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड Incidin या 70% EtOH के साथ सतहों की सफाई करके तैयार करें. प्लेस बाँझ 150 सेमी 2 सेल संस्कृति प्लेटें, 75 सेमी सेल संस्कृति बोतल (दोनों Corning), Pbs, सर्जिकल उपकरणों, सेल scrapers, ट्यूब धारक, 25 एमएल stripettes और 5 मिलीलीटर अपने साफ हुड में कुंद अंत उचित सुइयों के साथ सुसज्जित सीरिंज निष्फल.
- पूर्व गर्म अपने तैयार α सदस्य और ईजीएम 2 सेल संस्कृति 37 के माध्यम डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में.
- प्रसव के कमरे से अपने सेल संस्कृति हुड के साथ सुसज्जित प्रयोगशाला की हड्डी लाओ. लामिना का प्रवाह में गर्भनाल के हस्तांतरण के बाद यह दो बार (एक नई प्लेट को स्थानांतरित) पीबीएस में धोने के लिए रक्त कोशिकाओं contaminating से छुटकारा पाने के. एक तरफ यह एक बाँझ 5ml बाहर गर्भनाल के दूसरे छोर आने के तरल पदार्थ जब तक एक पीबीएस के साथ कुंद अंत सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज के साथ canulating बाद नाल की नस कुल्ला पूरी तरह से पारदर्शी (लाल रक्त संदूषण इंगित करता है) हो जाता है.
ECFCs:
- एक 75 सेमी 2 फ्लास्क (Corning) तैयार करें, यह लेबल और पूर्व गर्म ईजीएम-2 मध्यम 15-20 एमएल में भरें .
- कॉर्ड बाँझ पीबीएस के साथ भरा एक नया थाली में रखें.
शल्य कैंची लो और गर्भनाल को काट दो टुकड़े के बारे में लंबाई में 5 सेमी की (छोटे टुकड़े प्रक्रिया को आसान कर रहे हैं, क्योंकि नाल वाहिकाओं अपने अक्ष के साथ मुड़ रहे हैं) में. - नाल की शिरा (बड़े पोत) को खोजने की कोशिश करें, अपने शल्य कैंची की एक ब्लेड डालें और नस longitudinally कटौती. इस बिंदु पर यह मददगार हो सकता है अगर एक सहायक दो संदंश के साथ पहले से ही काट नस पकड़ जबकि तुम आगे कटौती कर सकते हैं सकता है.
- कॉर्ड पाई प्लेसCE पीबीएस के बिना एक नई प्लेट में कटौती नस के साथ, सेल खुरचनी और rubbings द्वारा एक छोर से दूसरे के भीतर endothelial () की नाल की नस की सतह का परिमार्जन ले. मध्यम में खुरचनी की नोक सफाई से अपने तैयार फ्लास्क कोशिकाओं स्थानांतरण. इस प्रक्रिया में कम से कम 10 बार दोहराएँ.
- अपने फ्लास्क बंद करें और इसे में डाल एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, 95% आर्द्रता).
MSCs:
- एक 150 सेमी 2 संस्कृति की थाली (Corning) तैयार है और इसे लेबल .
- (बंद endothelial परत scraping के बाद) की हड्डी का टुकड़ा ले लो और बहुत छोटे टुकड़ों में बाँझ कैंची और बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके पूरी की हड्डी में कटौती. की हड्डी के टुकड़े की अधिकतम आकार 1-2 मिमी होना चाहिए.
- अपनी संस्कृति थाली में पूर्व लेबल बाँझ संदंश के साथ अपने कॉर्ड टुकड़े स्थानांतरण. छोड़ने थाली मध्यम के साथ भरने से पहले 5 मिनट के लिए खोलने के टुकड़े की प्लास्टिक की सतह को अनुलग्नक मजबूत है.
- एक बार की हड्डी टुकड़े उचित प्लास्टिक से जुड़े हैं, धीरे से पूर्व गर्म अल्फा सदस्य संशोधित 30-35 एमएल में जोड़ें. न्यूनतम गति का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी टुकड़े संलग्न रहते हो की कोशिश करो.
- थाली को बंद करें और इसे में डाल एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, 95% आर्द्रता) .
भाग 3: सेल विस्तार और प्रतिरक्षा phenotype के प्रवाह cytometry द्वारा पुष्टि
सेल विस्तार
EFCFs:
- एक औंधा माइक्रोस्कोप और विनिमय पर अगले दिन endothelial कोशिकाओं की कुर्की की जाँच करें पूरे ईजीएम-2 मध्यम सभी गैर संलग्न कोशिकाओं और कणों से छुटकारा पाने के.
- संगम और विनिमय माध्यम से एक तीसरे सप्ताह में दो बार तक कोशिकाओं का विस्तार करें. जब संगम तक पहुँच जाता है, 0.05% Trypsin/0.7 मिमी EDTA के साथ कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें नई संस्कृति वाहिकाओं करने के लिए स्थानांतरण. अपने T75 फ्लास्क के भीतर कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, तुम और अपने नए बोतल के आकार और संख्या का चयन करने के लिए आगे विस्तार के लिए कम बोने घनत्व की गारंटी चाहिए.
- एक्सचेंज कोशिकाओं के विस्तार के दौरान एक सप्ताह में दो बार मध्यम के एक तिहाई.
MSCs:
- हड्डी से MSCs के परिणाम और अधिक समय लेते हैं, तो आप कम से कम 3-4 दिन इंतजार जब तक आप संलग्न ऊतक के टुकड़े के आसपास में धुरी आकार कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर जाँच कर सकते हैं. जब वहाँ पर्याप्त सेल से बाहर विकास, टुकड़े करने के लिए अलग है क्योंकि वे प्लास्टिक के साथ संपर्क खो जाते हैं.
- 10-12 दिनों के बाद ऊतक के टुकड़े को दूर करने के लिए, 0.05% Trypsin/0.7 मिमी EDTA के साथ प्लास्टिक से MSCs और अलग उन्हें नई संस्कृति वाहिकाओं करने के लिए स्थानांतरण. अपनी थाली के भीतर कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करता है आप और अपनी नई बोतल के आकार और संख्या तय करने के लिए आगे विस्तार के लिए कम बोने घनत्व की गारंटी चाहिए.
- एक्सचेंज कोशिकाओं के विस्तार के दौरान एक सप्ताह में दो बार मध्यम के एक तिहाई.
प्रवाह cytometry
उपकरण की जरूरत है:
प्रवाह cytometer (बी FACSCalibur), micronic ट्यूबों (Corning), ट्यूब धारक, भेड़ सीरम (अभिकर्मक अवरुद्ध), Eppifuge (Eppendorf), मोनोक्लोनल एंटीबॉडी
MSCs: CD45, CD14, CD19, एचएलए DR-CD31, CD73, CD90, CD105, निर्धारण नियंत्रण
ECFCs: CD45, CD14, CD19, एचएलए डॉ, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, निर्धारण नियंत्रण
- संगम तक पहुँचने के बाद, 0.05% Trypsin/0.7 मिमी EDTA और अपकेंद्रित्र के साथ 4 पर 300g पर सेल 7 मिनट के लिए अलग डिग्री सेल्सियस
- 1x10 6 संशोधित पीबीएस और 10% 4 बजे v / v 20 मिनट के लिए भेड़ सीरम ° सी. के साथ ब्लॉक unspecific एंटीबॉडी बंधन में कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए कोशिकाओं Resuspend
- लेबल micronic ट्यूब और फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के उपयुक्त एकाग्रता जोड़ें.
- प्रत्येक ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन (अवरुद्ध) के 50 μl जोड़ें और 4 बजे 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- संशोधित पीबीएस जोड़ने के लिए गैर - बाध्यकारी एंटीबॉडी हटायें द्वारा कोशिकाओं को धो लें.
- अपने लेबल कक्ष से प्रवाह cytometer पर जाएँ और विश्लेषण प्रदर्शन.
भाग 4: ECFC कॉलोनी विकास, निर्धारण, धुंधला हो जाना, और पदानुक्रम विश्लेषण
- बीज सेल संस्कृति प्लेटों में 3 या 10 वर्ग सेंटीमीटर प्रति कोशिकाओं की बहुत कम चढ़ाना घनत्व लगभग शुद्ध काटा ECFCs एकल कॉलोनी के विकास के लिए अनुमति देने के लिए.
- Exchange मध्यम दो बार एक सप्ताह की एक तिहाई.
- के बाद 14 दिनों (संस्कृति के अंत) मध्यम निकालने के लिए, Pbs के साथ दो बार धोने और बर्फ के ठंडे निर्धारण समाधान (एसीटोन 2: = 3 मेथनॉल) के साथ कालोनियों ठीक फ्रिज में 15 मिनट के लिए.
- नियतन समाधान त्यागें और प्लेटों के 10 मिनट के लिए शुष्क खुला छोड़ दें.
- 10 मिनट के लिए आसुत जल के साथ कोशिकाओं rehydrate.
- हैरिस Hematoxylin समाधान जोड़ें और 12 मिनट के लिए तय की कालोनियों दाग.
- एच matoxylin समाधान निकालें और पानी के नल के साथ प्लेटें शेष धुंधला समाधान के छुटकारा कुल्ला.
- प्रत्येक कॉलोनी के तस्वीरें ले लोएक stereomicroscope और आयात का उपयोग *. jpg या अपने कंप्यूटर पर *. tif प्रारूप फ़ाइलें.
- ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ तस्वीरें खोलें और विश्लेषण प्रत्येक कॉलोनी के सही सेल नंबर के रूप में एनीमेशन में वर्णित है.
- ImageJ सॉफ्टवेयर खोलें और एक कॉलोनी पुल डाउन मेनू में 'फ़ाइल \ खोलें' समारोह का उपयोग कर छवि आयात.
- समारोह में '\ घटाएँ पृष्ठभूमि प्रक्रिया' का उपयोग करके आगे बढ़ें
- कॉलोनी मार्जिन के निशान ImageJ मेनू में 'अण्डाकार * * ब्रश या चयन' समारोह का उपयोग करें.
- आसपास 'संपादित करें \ साफ बाहर' समारोह और फसल '\ फसल छवि' का चयन करके तस्वीर का उपयोग कर छवि साफ़ करें.
- दहलीज मैन्युअल रूप से समायोजित का उपयोग कर छवि \ \ थ्रेसहोल्ड को समायोजित करें 'समारोह में, इसलिए है कि सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से लाल रंग में रंग रहे हैं.
- 'विश्लेषण \ विश्लेषण कण' का चयन करके कॉलोनी के सेल नंबर की गणना. उचित सेटिंग्स (प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित) चुनें और चुनें 'ठीक है. परिणाम कोशिका गिनती और एक नए गिना कोशिकाओं की इसी रूपरेखा युक्त छवि सहित बॉक्स, दिखाई देंगे.
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Discussion
वहाँ से जो MSCs या अस्थि मज्जा, वसा ऊतकों, गर्भनाल रक्त, आदि सहित ECFCs पाने के लिए सूत्रों की एक किस्म है
यह एक ही स्रोत से progenitors के दोनों प्रकार के सीधे ऊतक और पोत उत्थान या ट्यूमर प्रगति के लिए योगदान की तरह प्रक्रियाओं में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की भागीदारी की तुलना करने के लिए आवश्यक है.
आसानी के साथ जो अलग करने के लिए और बाद में एक ही दाता से ECFCs और MSCs के ऑटोलॉगस जोड़े का अध्ययन इस विधि व्यक्तिगत प्रयोगों के भीतर दाता विविधताओं को छोड़कर के लिए फायदेमंद बनाता है.
Hematopoietic कोशिकाओं के साथ संभव संदूषण एक passaging कदम के माध्यम से कम से कम है और प्रवाह cytometry के साथ पुष्टि की.
यदि सही ढंग से किया है, अलग कक्षों (i) के पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के शेयर सुविधाओं, (ii) प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध होना चाहिए और (iii) शुद्ध प्रवाह cytometry द्वारा पुष्टि के रूप में.
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Disclosures
लेखकों डिक्लेअर करने के लिए ब्याज की किसी भी वित्तीय संघर्ष नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि के लिए उपयोगी टिप्पणियाँ, डेनिएला Thaler और Margaretha फादर hwirth तकनीकी सहायता के लिए, भाषाई संपादन के लिए मोनिका Farrell, Uwe लैंग, Margit Holzapfel और प्रसूति विभाग में सैंड्रा Eppich के लिए pHPL, ईवा Rohde और निकोल Hofmann प्रदान करने के लिए Katharina Schallmoser धन्यवाद डोरियों प्रदान करने के लिए.
इस काम ऑस्ट्रिया रिसर्च फाउंडेशन (FWF, अनुदान डी एस के लिए N211 - नेन), ऑस्ट्रियन अनुसंधान संवर्धन एजेंसी (FFG, अनुदान डी एस के लिए N200) द्वारा और वयस्क स्टेम सेल रिसर्च फाउंडेशन (ए आर) द्वारा समर्थित किया गया है. ए.आर. ग्राज़ की चिकित्सा विश्वविद्यालय के पीएचडी कार्यक्रम आण्विक चिकित्सा के एक साथी है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
