Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.
Abstract
De navelstreng is een rijke bron voor progenitor cellen met een hoog potentieel, met inbegrip proliferatieve mesenchymale stromale cellen (ook wel mesenchymale stamcellen, MSC's) en endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs). Beide celtypen zijn belangrijke spelers in het handhaven van de integriteit van de weefsels en zijn waarschijnlijk ook betrokken bij regeneratieve processen en tumorvorming.
Het bestuderen van hun biologie en functie in een vergelijkend onderzoek is het belangrijk om beide cellen types beschikbaar van dezelfde donor. Het kan ook nuttig zijn voor regeneratieve doeleinden te leiden MSC's en ECFCs uit hetzelfde weefsel.
Omdat de cellulaire therapieën moeten uiteindelijk hun weg vinden van bench to bedside we een nieuwe methode om te isoleren en verder progenitor cellen uit te breiden zonder het gebruik van dierlijke eiwitten. Gepoolde humane bloedplaatjes lysaat (pHPL) vervangen foetaal runderserum in alle stappen van ons protocol volledig voorkom contact van de cellen om xenogene eiwitten.
Deze video toont een methodologie voor de isolatie en uitbreiding van de stamcellen uit een navelstreng.
Alle materialen en procedures zullen worden beschreven.
Protocol
Deel 1: Het opzetten van
1. De voorbereiding van celkweekmedium
Voordat u begint met het medium voorbereiding verzamelen van alle materialen en gereedschappen u nodig heeft.
Ontdooi 2 x 56 ml porties van gepoolde humane bloedplaatjes lysaat (pHPL, self-made: referentie 1 & Jove # 1523), 10 ml van een 100x penicilline / streptomycine-oplossing, 2 x 5 ml van de L-Glutamine (beide Sigma).
Ontdooi de cytokine-en groeifactor aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hydrocortison, ascorbinezuur, Heparine, amfotericine aangeboden als 'single quots') gecorrigeerd voor de aanvulling van een fles (500 ml) van EGM-2 medium (Lonza).
Uit de koelkast neemt een fles van 500 ml elk van (i) alfa-gemodificeerd minimaal essentieel medium (a-MEM) en (ii) endotheliale basaal medium (EBM).
Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroming weefselkweek kap onder steriele omstandigheden.
Bereid zonder conserveermiddelen heparine (bijv. Biochrom), door het oplossen van het poeder tot een uiteindelijke concentratie van 1000 IU / ml met steriel water.
MSC-Medium:
Gebruik 500 ml a-MEM, voeg 56 ml van de ontdooide pHPL (zie ook een referentie voor meer details) en 2 IU / ml (= 224 pi van voorraad-oplossing) van het conserveermiddel-vrije Heparine (voorkomt stolling van het medium door de samenklontering van de fibrinogeen in het plasma) tot een uiteindelijke concentratie van 10% pHPL te bereiken. Daarnaast voegen Penicilline (100U/mL) / streptomycine (100μg/mL) oplossing en 2 mm van de L-glutamine (beide Sigma).
Filter het medium door middel van een 20 urn-poriegrootte vacuüm filter (Millipore). Passend etiket van de fles (inhoud, datum).
ECFC-Medium:
Gebruik een fles (500 ml) van de EBM, voeg de cytokine-monsters, 56 ml pHPL, 10 IU / ml (= 1120μl van voorraad-oplossing) van het conserveermiddel-vrije Heparine, Penicilline (100U/mL) / streptomycine (100 g / ml) oplossing en 2 mM L-glutamine aan de basale medium en filter met een 20 ul-poriegrootte vacuüm filter (Millipore). Passend etiket van de fles (inhoud, datum).
2. Sterilisatie van chirurgische instrumenten
Pincet, scherpe paar van chirurgische schaar en scalpel houder moet worden hitte gesteriliseerd erts steriele disposables.
3. De voorbereiding van buizen voor koord collectie
Voeg 500 IE conserveermiddel - gratis heparine tot 50 ml polypropyleen buizen (Falcon) en aan te passen aan een uiteindelijk volume van 20 mL met PBS. Breng de buizen in de verloskamer.
4. Informed consent (bevestigd door de lokale ethische commissie of IRB).
Vraag de ouders voorafgaand aan de levering als ze willen een stukje van het snoer doneren en adequaat te informeren over de doeleinden het zal dienen.
5. Koord donatie
Na levering en inspectie van de placenta en het snoer sneed een 10 cm stuk en onmiddellijk naar uw tube voorgevulde met heparine tot stolling van bloed in de rest van het snoer schepen te voorkomen. Doorgaan met celisolatie zo snel mogelijk.
Deel 2: Cel isolatie
- Bereid laminar flow weefselkweek kap met het schoonmaken van oppervlakken met Incidin of 70% EtOH. Plaats steriele 150 cm 2 celkweek borden, 75 cm celkweek kolven (beide Corning), PBS, gesteriliseerd chirurgische instrumenten, cel schrapers, buis houder, 25 ml stripettes en 5 ml spuiten zijn uitgerust met stompe naalden einde de juiste in uw schoongemaakt kap.
- Pre-warm je voorbereid α-MEM en EGM-2 celcultuurmedium tot 37 ° C in een waterbad.
- Breng het snoer van de levering ruimte om uw lab uitgerust met de celkweek kap. Na het overbrengen van de kabel in de laminaire stroming twee keer wassen in PBS (door de overdracht aan een nieuwe plaat) om zich te ontdoen van verontreinigende bloedcellen. Spoel de navelstreng ader na canulating het aan de ene kant met een steriele spuit 5 ml voorzien van een stomp uiteinde naald met PBS totdat de vloeistof die uit het andere uiteinde van de kabel volledig transparant (rood geeft aan besmet bloed).
ECFCs:
- Bereid een 75 cm 2 kolf (Corning), label en vul in 15-20 ml voorverwarmde EGM-2 medium.
- Plaats het snoer in een nieuwe plaat gevuld met steriele PBS.
Neem de chirurgische schaar en knipte de navelstreng in twee stukken van ongeveer 5 cm lang (korte stukken zijn gemakkelijker te verwerken, omdat de navelstreng schepen worden gedraaid rond de eigen as). - Probeer de navelstreng ader (grote schip) te vinden, plaatst u een blad van uw chirurgische schaar en in de lengte snijden van de ader. Op dit punt kan het nuttig zijn als een assistent kan het al gesneden ader met twee tang vast te houden terwijl u zich snijdt verder.
- Plaats het snoer taartce met de cut ader in een nieuwe plaat zonder PBS, neemt de cel schraper en schraap van de innerlijke (endotheel) oppervlak van de navelstreng ader door wrijfsels van het ene eind naar het andere. Overdracht van de cellen naar uw voorbereid kolf door het reinigen van de tip van de schraper in het medium. Herhaal deze procedure minstens 10 keer.
- Sluit je kolf en zet het in een incubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% vochtigheid).
MSC's:
- Bereid een 150 cm 2 cultuur plaat (Corning) en labelen.
- Neem het stuk touw (na afschrapen van de endotheliale laag) en snijd de hele kabel in heel kleine stukjes met behulp van steriele schaar en steriele scalpel. Maximale grootte van het snoer stukken moet 1-2 mm.
- Zet uw koord stukken met de steriele pincet in je pre-gelabeld cultuur plaat. Bij het verlaten van de plaat te openen gedurende 5 minuten voor het vullen met medium, is de bevestiging van de stukken om het plastic oppervlak versterkt.
- Zodra het snoer stukken op passende wijze worden aangesloten op het plastic, voorzichtig toe te voegen in 30-35 ml voorverwarmde alpha gewijzigd MEM. Probeer de laagste snelheid te gebruiken om zeker te zijn dat alle stukken aangesloten blijven.
- Sluit de plaat en zet het in een incubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% vochtigheid).
Deel 3: Cel uitbreiding en bevestiging van immuun-fenotype door flowcytometrie
Celexpansie
EFCFs:
- Controleer de bevestiging van de endotheelcellen de volgende dag een omgekeerde microscoop en uitwisseling hele EGM-2 medium om zich te ontdoen van alle niet-ingeschreven cellen en deeltjes.
- Vouw de cellen tot de samenvloeiing en uitwisseling een derde van het medium twee keer per week. Wanneer samenvloeiing is bereikt, los van de cellen met 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA en overbrengen naar nieuwe cultuur schepen. Afhankelijk van het aantal cellen in je T75 fles, moet u kiezen voor de grootte en het aantal van uw nieuwe kolven om een lage dichtheid zaaien garantie voor een verdere expansie.
- Uitwisseling een derde van het medium twee keer per week tijdens de expansie van de cellen.
MSC's:
- De uitgroei van MSC's uit het koord zal meer tijd vergen, zodat je kunt wachten op zijn minst 3-4 dagen totdat je op een omgekeerde microscoop te controleren op het verschijnen van spoelvormige cellen in de omgeving van de bijgevoegde stukken weefsel. Wanneer er voldoende cellen out-groei, de stukken hebben de neiging om los te maken, want ze verliezen het contact met de plastic.
- Na 10-12 dagen verwijderd van het weefsel stukken, maak de MSC's uit de plastic met 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA en overbrengen naar nieuwe cultuur schepen. Afhankelijk van de hoeveelheid cellen in uw bord moet u de grootte en het aantal van uw nieuwe kolven besluiten om een lage dichtheid zaaien garantie voor een verdere expansie.
- Uitwisseling een derde van het medium twee keer per week tijdens de expansie van de cellen.
Flowcytometrie
Benodigdheden:
Flowcytometer (BD FACSCalibur), Micronic buizen (Corning), buis houder, schapen serum (blokkeren van reagens), Eppifuge (Eppendorf), monoclonale antilichamen
MSC's: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, isotype controle
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, isotype controle
- Na het bereiken van samenvloeiing, los van de cel met 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA en centrifugeer bij 300g gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen tot een concentratie van 1x10 6 cellen / ml in gemodificeerde PBS en blok niet-specifieke binding van antilichaam met 10% v / v schaap serum gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Het etiket van de Micronic buizen en voeg de juiste concentratie van TL-gelabelde antilichamen.
- Voeg 50 pi celsuspensie (geblokkeerde) aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen door het toevoegen van aangepaste PBS om niet-bindende antilichamen te verwijderen.
- Ga met je label cel naar de flowcytometer en het uitvoeren van de analyse.
Deel 4: ECFC kolonie groei, fixatie, vlekken en hiërarchie analyse
- Zaad de vrijwel pure geoogst ECFCs bij zeer lage dichtheid plating van 3 of 10 cellen per vierkante centimeter in celcultuur platen te zorgen voor enkele kolonie groei.
- Uitwisseling een derde van het medium twee keer per week.
- Na 14 dagen (einde van de cultuur) te verwijderen medium, twee keer wassen met PBS en bevestig de kolonies met ijs koude fixatie-oplossing (Aceton: Methanol = 3: 2) gedurende 15 minuten in de koelkast.
- Gooi de fixatie-oplossing en laat de platen te openen om te drogen gedurende 10 minuten.
- Hydrateren van de cellen met gedestilleerd water gedurende 10 minuten.
- Voeg Harris Hematoxylin oplossing en vlekken op de vaste kolonies voor 12 minuten.
- Verwijder H matoxylin oplossing en spoel de borden met leidingwater om zich te ontdoen van de resterende kleuroplossing.
- Maak foto's van elke kolonie doormet behulp van een stereomicroscoop en importeren *. jpg of *. tif-bestanden op uw computer.
- Open de foto's met ImageJ software en analyseren van de juiste mobiele nummer van elke kolonie, zoals beschreven in de animatie.
- Open de ImageJ software en importeer een kolonie beeld met behulp van de 'File \ Open' functie in het pull-down menu.
- Ga verder met behulp van het 'Proces \ Trek Achtergrond' functie
- Gebruik de '* * elliptische of borstel selectie' functie in de ImageJ menu om de kolonie marge te markeren.
- Schakel het rond afbeelding met de 'Edit \ Clear Outside' functie en de foto bijsnijden door het selecteren van "Image \ Crop '.
- Handmatig aanpassen van de drempel met de 'Image \ Pas \ Threshold' functie, zodat alle cellen volledig gekleurd in het rood.
- Tel het aantal cellen van de kolonie door het selecteren van 'Analyze \ Analyseer Deeltjes'. Kies de juiste instellingen (geoptimaliseerd voor elke cel type) en kies voor 'OK'. De resultaten box, inclusief celgetal en een nieuwe afbeelding met de bijbehorende contouren van de getelde cellen zal verschijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een variëteit aan bronnen van waaruit u MSC's of ECFCs waaronder beenmerg, vetweefsel, navelstrengbloed, enz. te krijgen
Het is noodzakelijk om beide soorten van voorlopercellen uit dezelfde bron om rechtstreeks vergelijken van de betrokkenheid van de verschillende celtypes in processen zoals weefsel en schip regeneratie of bijdrage aan de progressie van de tumor.
Het gemak waarmee te isoleren en vervolgens autologe paren van ECFCs en MSC's studie van dezelfde donor maakt deze methode voordelig voor het uitsluiten van donoren variaties binnen de individuele experimenten.
Een mogelijke verontreiniging met hematopoietische cellen wordt geminimaliseerd door een passage stap en bevestigd met flowcytometrie.
Als dit juist gebeurt, moet de geïsoleerde cellen (i) aandeel kenmerken van progenitor cellen, (ii) beschikbaar zijn voor experimentele transplantatie in voldoende hoeveelheden en (iii) zuiver zijn zoals bevestigd door flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangenverstrengeling te verklaren.
Acknowledgments
De auteurs danken Katharina Schallmoser voor het verstrekken van pHPL, Eva Rohde en Nicole Hofmann voor nuttige opmerkingen bij het manuscript, Daniela Thaler en Margaretha Fr hwirth voor technische bijstand, Monica Farrell voor vertalers, Uwe Lang, Margit Holzapfel en Sandra Eppich bij Dept Verloskunde voor het verstrekken van de koorden.
Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Research Foundation (FWF, subsidie N211-NAN naar DS), het Oostenrijkse Research Promotion Agency (FFG verlenen N200 naar de DS) en door The Adult Stem Cell Research Foundation (AR). AR is een fellow van de PhD-programma Molecular Medicine van de Medische Universiteit van Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
