Summary
Detta protokoll beskriver isolering och efterföljande expansion av mesenkymala stromaceller och endotelceller kolonibildande celler utan användning av djur-serum för att generera autologa par för experimentell transplantation.
Abstract
Navelsträngen är en rik källa för stamceller med hög proliferativ potential inklusive mesenkymala stromaceller (även kallad mesenkymala stamceller, MSC) och endotelceller kolonibildande progenitorceller (ECFCs). Båda celltyperna är nyckelaktörer i att upprätthålla integriteten i vävnaden och är troligen också involverade i regenerativa processer och tumörbildning.
Att studera biologi och funktion i ett jämförande sätt är det viktigt att ha både celler typer som finns från samma donator. Det kan också vara till nytta för regenerativ syfte att härleda MSC och ECFCs från samma vävnad.
Eftersom cellulära terapier bör så småningom hitta sin väg från bänk till sängen vi etablerat en ny metod för att isolera och ytterligare expandera stamceller utan att använda animaliskt protein. Poolade humana trombocyter lysat (pHPL) ersatt fetalt bovinserum i alla steg i våra protokoll att helt undvika kontakt celler till artfrämmande proteiner.
Denna video visar en metod för isolering och expansion av progenitorceller från en navelsträng.
Allt material och metoder kommer att beskrivas.
Protocol
Del 1: Ställa in
1. Beredning av cellodlingsmedium
Innan du börjar på medellång beredningen samla alla material och verktyg du behöver.
Tina 2 x 56 ml alikvoter av poolade humana trombocyter lysat (pHPL, self-made: referens 1 & JUPITER # 1523), 10 ml av en 100x Penicillin / streptomycin lösning, 2 x 5 ml av L-glutamin (båda Sigma).
Tina cytokin och tillväxt alikvoter (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hydrokortison, askorbinsyra, Heparin, amfotericin ges som "enda quots) justerat för komplettering av en flaska (500 ml) av EGM-2 medium (Lonza).
Ur kylen tar en 500 ml flaska var och en av (i) alfa-modifierad minimal viktigt medium (en-MEM) och (ii) endotelceller bassubstratets (EBM).
Samtliga av följande steg utförs i ett laminärt flöde vävnadsodling huva under sterila förhållanden.
Förbered utan konserveringsmedel heparin (t.ex. Biochrom) genom att lösa upp pulvret till en slutlig koncentration på 1000 IU / ml med sterilt vatten.
MSC-Medium:
Använd 500 ml a-MEM, tillsätt 56 ml av den upptinade pHPL (se även referens 1 för ytterligare information) och 2 IU / ml (= 224 ìl av stamlösning) av konserveringsmedel Heparin (undviker koagulering av mediet genom klumpar av fibrinogen i plasma) för att nå en slutlig koncentration på 10% pHPL. Dessutom lägger Penicillin (100U/mL) / streptomycin (100μg/mL) lösning och 2mm av L-Glutamin (båda Sigma).
Filtrera medium genom en 20 m-porstorlek vakuumfilter (Millipore). Märk flaskan lämpligt (innehåll, datum).
ECFC-Medium:
Använd en flaska (500 ml) av EBM, lägg till cytokin-alikvoter, 56 ml pHPL, 10 IE / ml (= 1120μl av stamlösning) av konserveringsmedel Heparin, penicillin (100U/mL) / streptomycin (100 g / ml) och 2mm av L-Glutamin för att bassubstratets och filter med en 20 l-porstorlek vakuumfilter (Millipore). Märk flaskan lämpligt (innehåll, datum).
2. Sterilisering av kirurgiska instrument
Tång, kraftig par av kirurgisk sax och skalpell innehavaren måste värma steriliseras malm sterila engångsmaterial.
3. Beredning av rör för kabel samlingen
Tillsätt 500 IE av konserveringsmedel - fri heparin till 50 ml polypropylen rör (Falcon) och justera till en slutlig volym på 20 ml med PBS. Överför rören in i förlossningsrummet.
4. Informerat samtycke (bekräftas av lokala etiska kommittéer eller IRK).
Be föräldrarna innan leverans om de vill donera en bit av sladden och på lämpligt sätt informera dem om de ändamål kommer att tjäna.
5. Cord donation
Efter leverans och inspektion av placenta och rep avskurna en 10 cm bit och omedelbart överföra den till ditt rör förfyllda med heparin för att undvika koagulering av de återstående blod inne i sladden fartyg. Fortsätt med cell isolering så snart som möjligt.
Del 2: Cell isolering
- Förbered laminärt flöde huva vävnadsodling genom att rengöra ytor med Incidin eller 70% EtOH. Placera steril 150 cm 2 cellkultur plattor, 75 cm cellkultur kolvar (båda Corning), PBS, steriliseras kirurgiska instrument, skrapor cell, rörhållare, 25 ml stripettes och 5 ml sprutor försedda med trubbiga änden nålar korrekt i ditt rengjorda huva.
- Pre-värma förberedd α-MEM och EGM-2 cellkulturmedium till 37 ° C i ett vattenbad.
- Ta med sladden från förlossningsrummet till ditt labb utrustad med cellodling huven. Efter överföring sladden till laminär strömning tvätta den två gånger i PBS (genom att förflyttas till en ny platta) för att bli av kontaminerande blodkroppar. Skölj navelsträngen ven efter canulating det på ena sidan med en steril 5 ml spruta försedd med en trubbig slutet nål med PBS tills vätskan kommer ut i andra änden av sladden blir helt transparent (rödaktig indikerar blodsmitta).
ECFCs:
- Förbered en 75 cm 2-kolv (Corning), märk den och fyll i 15-20 ml förvärmda EGM-2 medium.
- Sätt in sladden i en ny tallrik fylld med steril PBS.
Ta kirurgiska saxen och klippa navelsträngen i två bitar ca 5 cm långa (korta bitar är lättare att bearbeta, eftersom navelsträngen fartygen är vridna längs axeln). - Försök att hitta navelsträngen ven (stort fartyg), sätt ett blad av dina kirurgiska saxen och klippa venen longitudinellt. Vid denna punkt kan det vara bra om en assistent kan hålla redan skär ven med två pincett medan du klipper ytterligare.
- Placera sladden pajce med skära ven i en ny tallrik utan PBS, tar cellen skrapan och skrapa av det inre (endotelceller) ytan av navelsträngen ven av gnidningarna från ena änden till den andra. Överför cellerna till din förberedd kolv genom att rengöra toppen på skrapan i mediet. Upprepa denna procedur minst 10 gånger.
- Stäng din kolv och lägg den i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% luftfuktighet).
MSC:
- Förbered en 150 cm 2 odlingsplatta (Corning) och märk den.
- Ta snöre (efter skrapas av endotelceller lager) och kapa hela sladden i mycket små bitar med hjälp av steril sax och steril skalpell. Maximal storlek på sladden bitarna ska vara 1-2 mm.
- Överför dina sladd bitar med steril pincett till ditt före-märkta odlingsplatta. Genom att plattan öppet i 5 minuter innan du fyller på medium, är infästningen av bitarna till plastytan stärkas.
- När sladden bitarna är ansluten korrekt till plast, försiktigt lägga i 30-35 ml förvärmda alfa modifierad MEM. Försök att använda den lägsta hastigheten vara säker på att alla delar sitter kvar.
- Stäng plattan och lägg den i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% luftfuktighet).
Del 3: Cell expansion och bekräftelse av immun-fenotyp med flödescytometri
Cell Expansion
EFCFs:
- Kontrollera fastsättning av endotelceller nästa dag ett inverterat mikroskop och utbyta hela EGM-2 medel att bli av med alla grupplösa celler och partiklar.
- Expandera celler tills sammanflödet och utbyte en tredjedel av mediet två gånger i veckan. När sammanflödet nås, lossa cellerna med 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA och överföra dem till nya odlingskärl. Beroende på antalet celler i din T75 kolven, bör du välja storlek och antal på din nya kolvar för att garantera låg seedning densitet för ytterligare expansion.
- Byta ut en tredjedel av mediet två gånger i veckan under utbyggnaden av celler.
MSC:
- Den utväxt av MSC från sladden tar längre tid, så du kan vänta minst 3-4 dagar tills du kolla på ett inverterat mikroskop för uppkomsten av spolformad celler i omgivningen av bifogade vävnaden bitar. När det finns tillräckligt med celler ut-tillväxt, de bitar tenderar att lösgöra eftersom de förlorar kontakten med plast.
- Efter 10-12 dagar bort vävnaden bitar, ta bort MSC från plasten med 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA och överföra dem till nya odlingskärl. Beroende på mängden av celler i din tallrik ska du bestämma storlek och antal på din nya kolvar för att garantera låg seedning densitet för ytterligare expansion.
- Byta ut en tredjedel av mediet två gånger i veckan under utbyggnaden av celler.
Flödescytometri
Utrustning som behövs:
Flödescytometer (BD FACSCalibur), Micronic rör (Corning), rör innehavare, får serum (blockering reagens), Eppifuge (Eppendorf), monoklonala antikroppar
MSC: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, isotyp kontroller
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, isotyp kontroller
- Efter att ha nått sammanflödet, lossa cellen med 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA och centrifugera vid 300g i 7 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera cellerna till en koncentration av 1x10 6 celler / ml i modifierad PBS och blockera ospecifik antikroppsbindning med 10% v / v får serum i 20 minuter vid 4 ° C.
- Märk micronic rören och tillsätt lämplig koncentration av fluorescerande märkta antikroppar.
- Tillsätt 50 l cellsuspension (blockerad) till varje rör och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna genom att lägga modifierad PBS för att avlägsna icke-bindande antikroppar.
- Gå med din märkta cellen till flödescytometern och utföra analysen.
Del 4: ECFC koloni tillväxt, fixering, färgning och hierarki analys
- Seed det nästan ren skördade ECFCs vid mycket låga plätering täthet av 3 eller 10 celler per kvadratcentimeter i form av plattor cellodling för att tillåta enstaka koloni tillväxt.
- Byta ut en tredjedel av mediet två gånger i veckan.
- Efter 14 dagar (i slutet av kultur) tar bort medium, tvätta två gånger med PBS och fixa kolonier med iskalla fixering lösning (Aceton: Metanol = 3: 2) i 15 minuter i kylskåpet.
- Kasta fixering lösningen och låt plattorna öppen för att torka i 10 minuter.
- Rehydrera cellerna med destillerat vatten i 10 minuter.
- Lägg Harris Hematoxylin lösning och färga den fasta kolonier i 12 minuter.
- Ta bort H matoxylin lösningen och skölj plattorna med kranvatten för att bli av resterande färglösningen.
- Ta bilder av varje koloni avmed hjälp av ett stereomikroskop och importera *. jpg eller *. tif-format på datorn.
- Öppna bilder med ImageJ programvara och analysera exakt cellen antalet av varje koloni som beskrivs i animationen.
- Öppna ImageJ programvaran och importera en koloni bild med 'Arkiv \ Open "-funktionen i rullgardinsmenyn.
- Fortsätt genom att använda "Process \ Subtrahera Bakgrund" funktion
- Använd '* elliptisk * eller pensel urval "funktion i ImageJ menyn för att markera kolonin marginal.
- Rensa den omgivande bilden med hjälp av "Redigera \ Rensa utanför" funktion och beskära bilden genom att välja 'Image \ Crop ".
- Justera tröskeln manuellt med "Image \ Justera \ Threshold"-funktion, så att alla celler är helt färgade i rött.
- Räkna mobilnummer av kolonin genom att välja "Analyze \ analysera partiklar". Välj lämpliga inställningar (optimerad för varje celltyp) och välj "OK". Resultaten rutan, inklusive celltal och en ny bild som innehåller motsvarande konturerna av räknade celler visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns en mängd olika källor som få MSC eller ECFCs inklusive benmärg, fettvävnad, navelsträngsblod, etc.
Det är nödvändigt att få båda typerna av stamceller från samma källa att direkt jämföra medverkan av de olika celltyper i processer som vävnad och kärlåterväxt eller bidrag till tumörprogression.
Den lätthet med vilken för att isolera och därefter studera autologa par ECFCs och MSC från samma givare gör denna metod fördelaktig för att utesluta givare variationer inom enskilda experiment.
Eventuell kontaminering med hematopoetiska celler minimeras genom en passaging steg och bekräftas med flödescytometri.
Om gjort rätt, bör isolerade celler (i) dela funktioner i stamceller, (ii) vara tillgänglig för experimentell transplantation i tillräckliga mängder och (iii) vara ren vilket bekräftas av flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte några ekonomiska intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna tackar Katharina Schallmoser för att ge pHPL, Eva Rohde och Nicole Hofmann för värdefulla kommentarer till manuskriptet, Daniela Thaler och Margaretha Fr hwirth för tekniskt stöd, Monica Farrell för språklig redigering, Uwe Lang, Margit Holzapfel och Sandra Eppich vid Institutionen för obstetrik för att tillhandahålla sladdar.
Detta arbete har fått stöd av den österrikiska Research Foundation (FWF, bevilja N211-NAN till DS), den österrikiska Research Promotion Agency (FFG bevilja N200 till DS) och av adulta stamceller Research Foundation (AR). AR är en karl av forskarutbildningen molekylär medicin vid medicinska universitetet i Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
