Summary
这个协议描述不使用动物血清中产生自体对实验移植的目的的间质基质细胞和内皮细胞集落形成细胞的分离和随后的扩大。
Abstract
脐带是一种具有高增殖潜能，包括间质的基质干细胞（也称为间质干细胞，MSCS）和内皮细胞集落形成祖细胞（ECFCs）的祖细胞的丰富来源。这两种类型的细胞，在维持组织的完整性关键人物，并可能也参与再生过程和肿瘤的形成。
要比较的方式研究它们的生物学和功能，它是重要的，都从同一供体细胞类型。这也可能是来自同一组织的干细胞和ECFCs，有利于再生的目的。
由于细胞疗法，最终找到自己的方式从替补到床边，我们建立了一个新的方法来隔离和进一步扩大不使用动物性蛋白质的祖细胞。在我们的协议中的所有步骤汇集人类血小板裂解液（pHPL）所取代胎牛血清完全避免接触细胞异种蛋白质。
该视频演示了从一个脐带祖细胞的分离和扩张的方法。
所有材料和程序进行说明。
Protocol
第1部分：设置
1。细胞培养液的制备
在开始培养基的配制之前，收集所有的材料和工具，你需要。
解冻2 × 56毫升分装汇集了人类的血小板裂解（pHPL，自制：参考文献1的Jove＃1523），一个100X青霉素/链霉素溶液，10毫升× 5毫升（L -谷氨酰胺两个西格玛）。
解冻的细胞因子和生长因子等分（血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子，氢化可的松，抗坏血酸，肝素，两性霉素作为“单一quots”提供），补充EGM - 2培养基（龙沙）1瓶（500毫升）调整。
从冰箱里取一个500毫升瓶装（I）α-修改最小的必不可少的媒介（A - MEM）及（ii）内皮细胞培养基（EBM）。
以下所有步骤都是层流组织培养罩在无菌条件下进行。
准备到终浓度为1000 IU / mL的无菌水溶解的粉末不含防腐剂的肝素（例如，Biochrom）。
MSC介质：
使用500毫升的A - MEM，添加56毫升解冻pHPL（亦见进一步的细节参考1）和2 IU /毫升（= 224μL原液）（避免通过介质凝固结块的防腐剂，无肝素在血浆中的纤维蛋白原），达到了10％pHPL的终浓度。此外，添加青霉素（100U/mL）/链霉素（100μg/mL）解决方案的L - Glutamin 2MM（均为Sigma公司）。
过滤介质，通过一个20微米孔径真空过滤机（Millipore公司）。瓶适当的标签（内容，日期）。
ECFC，中等：
使用EBM的瓶（500毫升），添加细胞因子等分pHPL，10国际单位/毫升（原液1120μl），56毫升的不含防腐剂的肝素，青霉素（100U/mL）/链霉素（100克/毫升）溶液和培养基和20μL孔径真空过滤机（微孔）过滤器的L - 2MM Glutamin。瓶适当的标签（内容，日期）。
2。手术器械的消毒
钳，一双锋利的手术剪刀和手术刀持有人必须是热消毒无菌一次性矿石。
3。线集合管的制备
500 IU的防腐剂 - 免费肝素添加50毫升聚丙烯管（猎鹰），并调整到终体积为20毫升，用PBS。转移到产房管。
4。知情同意（由您当地的伦理委员会或IRB确认）。
要求家长在交付之前，如果他们想捐一块的电线，并充分告知他们的目的，它将成为。
5。线捐赠
分娩后，胎盘和脐带血检查切断一个10厘米的片，并立即传输到你的管与肝素预充式，以避免其余索血管内血液凝固。尽快继续进行细胞分离。
第2部分：细胞分离
- 准备Incidin或70％乙醇清洗表面层流组织培养罩。放置无菌150厘米2细胞培养板，75厘米的细胞培养瓶（两个康宁），PBS，消毒手术器械，细胞刮削器，管座，25毫升stripettes，5毫升注射器钝端针头清洗油烟机的适当配备。
- 预温您准备的α- MEM和EGM - 2细胞培养液至37 ° C水浴中。
- 把电源线从产房到您的实验室配备了细胞培养罩。转移到层流线后洗两次在PBS（转移到一个新的板块），以获得摆脱污染血细胞。 canulating一方5ML配备一个钝端，用PBS液，直到线的另一端出来的针，用无菌注射器冲洗干净后脐静脉变得完全透明（偏红表明血液污染）。
ECFCs：
- 准备一个75厘米的 2瓶（康宁），标签，并填写预热EGM - 2培养基15-20毫升。
- 放入无菌PBS填充一个新的板块的线。
以手术剪脐带切成约5厘米长的片（小品更容易处理，因为脐部血管沿其轴扭曲）。 - 试着找到脐静脉（大血管），您的手术剪刀插入一个刀片和纵向切开静脉。在这一点上可能会有所帮助，如果助理可以容纳两个钳已经切开静脉，当你进一步削减。
- 将线馅饼行政长官在没有新盘PBS切开静脉，脐静脉内（内皮细胞）从一端到另一面拓片细胞刮刀和刮。细胞传送到您准备的烧瓶，在中期清洁刮板的一角。重复此过程，至少10倍。
- 关闭您的容量瓶中，并把它成一个孵化器（37 ° C，5％的CO 2，湿度95％） 。
MSCS：
- 准备了一个150平方厘米培养板（康宁）和标签。
- 线片（刮后的内皮细胞层）和整线使用无菌剪刀，无菌手术刀切成非常小的碎片。线片的最大尺寸应该是1-2毫米。
- 转移到您预先标记的培养板无菌镊子线片。离开板打开填充介质的前5分钟，附件件塑料表面得到加强。
- 一旦适当的塑料连接线片，轻轻地添加30-35毫升修改纪念预热阿尔法。尝试使用的最低速度，以确保所有的作品则附加。
- 关闭板，并把它孵化器（37 ° C，5％CO 2，湿度95％） 。
第3部分：细胞扩增和免疫表型流式细胞仪检测确认
细胞扩增
EFCFs：
- 检查第二天的内皮细胞附着在一个倒置显微镜和交流整个EGM - 2摆脱所有非贴壁细胞和颗粒的介质。
- 展开，直至汇合和交流的一个中期的三分之一每星期两次的细胞。达到汇合时，0.05％Trypsin/0.7 mM的EDTA分离细胞和它们转移到新的培养容器。根据你的T75烧瓶内的细胞数量，你应该选择你的新烧瓶的大小和数量，以保证低播种密度为进一步扩大。
- 交易所三分之一每周两次在扩大细胞的培养基。
MSCS：
- 从线的MSCs生长需要更多的时间，这样你就可以等待至少3-4天，直到你在一个倒置显微镜检查梭形细胞连接的组织块周围的外观。当有足够的出细胞生长，件往往要分离，因为他们失去了与塑料的接触。
- 后10-12天取出组织块，从塑料中分离MSCs的0.05％Trypsin/0.7 mM的EDTA，他们转移到新的培养容器。根据你的盘子内对细胞的数量，你应该决定您的新烧瓶的大小和数量进一步扩大，以保证接种密度低。
- 交易所三分之一每周两次在扩大细胞的培养基。
流式细胞仪
所需设备：
流式细胞仪（BD FACSCalibur），micronic管（康宁），管座，羊血清（阻断剂），Eppifuge（Eppendorf公司），单克隆的抗体
MSCS：CD45，CD14，CD19，HLA - DR，CD31，CD73，CD90，CD105，同型对照
ECFCs：CD45，CD14，CD19，HLA - DR，CD31，CD34，CD90，CD105，CD144，CD146，同型对照
- 达到汇合后，用0.05％Trypsin/0.7 mM的EDTA和离心分离的细胞为7分钟，4300克° C。
- 悬浮细胞浓度1 × 10 6细胞/ mL，在修改的PBS和块用10％V / V羊血清20分钟在4 ° C的非特异性抗体结合中
- 标签micronic管，并添加适当浓度的荧光标记抗体。
- 每管添加50μL细胞悬液（封锁），孵育30分钟，在4 ° C。
- 洗净加入修改PBS删除非约束性抗体的细胞。
- 您的标记细胞，流式细胞仪进行分析。
第4部分：ECFC菌落生长，固定，染色和层次分析法
- 种子几乎纯粹的收获非常低的密度每平方厘米3或10细胞在细胞培养板电镀ECFCs允许单菌落生长。
- 交易所三分之一的介质，每周两次。
- 后14天（文化底）去除培养基，用PBS洗两次，并修复与冰冷的固定解决方案（2丙酮：甲醇= 3）的殖民地，在冰箱15分钟。
- 放弃固定的解决方案，并离开板打开干10分钟。
- 10分钟，用蒸馏水补充水分细胞。
- 添加哈里斯苏木素溶液染色12分钟的固定殖民地。
- 删除H matoxylin解决方案，并用自来水冲洗板摆脱其余染色液。
- 采取每个殖民地的照片使用立体显微镜和导入*. jpg或*. TIF格式的文件到您的计算机。
- ImageJ软件打开照片和动画中的描述分析的准确的细胞数，每个殖民地。
- 打开ImageJ软件，并在下拉菜单中使用“文件\打开”功能导入一个殖民地的形象。
- 继续使用“过程\减去背景”功能
- 使用ImageJ菜单中的“选择*椭圆*或刷”功能，以纪念殖民地保证金。
- 清除周围的图像，使用“编辑\清除外”的功能和作物的图片，选择“图像\作物。
- 使用“图像手动调整阈值\调整\门槛”的功能，使所有的细胞都完全红色。
- 通过选择“分析\分析粒子的计数殖民地的细胞数。选择适当的设置（针对不同的细胞类型进行了优化），并选择“确定”。结果框，包括细胞计数和一个新的形象包含的计数细胞相应的轮廓会出现。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
有一个从中获取干细胞或ECFCs包括骨髓，脂肪组织，脐带血，等各种来源
从相同的源祖细胞两种类型直接比较的样组织和血管再生或肿瘤进展的贡献过程中的不同类型的细胞参与，这是必要的。
隔离，并随后从同一供体研究ECFCs和干细胞自体对缓解使得这种方法排除在个别实验的捐助变化的优势。
与造血干细胞可能造成的污染降到最低通过传代步骤，并用流式细胞仪检测证实。
如果做得正确，分离出的细胞（I）祖细胞的共享功能，（二）提供足够数量的实验移植（三）是纯粹的流式细胞仪检测证实。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有财务申报任何利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢提供有用的意见，手稿，丹妮拉泰勒和Margaretha神父hwirth提供技术援助，莫妮卡语言编辑法雷尔，乌韦郎，马尔吉特Holzapfel和桑德拉部Eppich妇产科pHPL，伊娃罗德和妮可霍夫曼卡塔琳娜Schallmoser提供的线。
这项工作一直由奥地利研究基金会（FWF，授予N211南到DS），奥地利研究促进署（FFG，授予N200到DS）和成体干细胞研究基金会（AR）的支持。 AR是博士课程的格拉茨医科大学分子医学研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
