חזותי יחיד מולקולת הדנ"א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

Abstract

אנו מתארים פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוססי בזמן אמת על קיום שיטת שכפול ה-DNA ברמה מולקולה בודדת. תבנית עגולה, DNA מפוצל מחובר coverslip כוס פונקציונליות ו משוכפל בהרחבה לאחר המבוא של חלבונים שכפול נוקלאוטידים (איור 1). גדל פעמיים גדיל DNA מוצר (dsDNA) מתרחבת עם זרימה למינרית ו דמיינו באמצעות צבע intercalating. מדידת המיקום של סוף DNA גדל בזמן אמת מאפשר קביעה מדויקת של קצב שכפול (איור 2). יתר על כן, אורך של מוצרי ה-DNA השלימה דיווחים על processivity של שכפול. ניסוי זה יכול להתבצע בקלות ובמהירות דורש רק מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמה רגישה למדי.

Protocol

לפני ביצוע ניסוי יחיד מולקולה שכפול, כמה חומרים צריכים להיות מוכנים מראש.

1. שכפול ה-DNA תבנית

המצע עבור התגובה שכפול הוא biotinylated, מעגל זנב M13 מתגלגל מוכן באמצעות תקן ^1,2 טכניקות לביולוגיה מולקולרית.

חומרים: M13mp18 גדילי דנ"א יחיד, תחל Biotinylated oligonucleotide הזנב (5'-ביוטין-T ₃₆ AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 "), T7-DNA פולימראז, גוש חום, פנול / Isoamyl אלכוהול / כלורופורם

1. לחשל אוליגו זנב biotinylated ל M13 על ידי הוספת יתר של פי 10 של אוליגו ב TBS חיץ (330 nM זנב אוליגו, 33 nM M13).
2. מחממים את התערובת ל 65 ° C בבלוק חום. מחומם פעם, להפוך את חום לחסום את ולאפשר קירור איטי שצריך לחשל תחל.
3. מוסיפים את M13 דרוך אל תערובת של 64 nM DNA פולימראז T7 ו חיץ T7 שכפול המכיל dNTPs ו MgCl _2.
4. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות להרוות עם 100 mM EDTA.
5. לטהר את מלא ב-DNA מוצר עם מיצוי פנול / כלורופורם / isoamyl אלכוהול dialyze למאגר TE או אחסון אחר חיץ מתאים לקבוע ריכוז ה-DNA (Back-תמצית כל שלב אורגני לשחזר שום שיורית דרוך M13).
6. איטרציה אחת של הכנת תבנית יכול בקלות להפוך כמה מיליליטרים של תבנית ריכוז nanomolar, מספיק מאות עד אלפי ניסויים-מולקולה בודדת.

2. פונקציונליות Coverslips

לחיבור ה-DNA כדי coverslip הזכוכית, הזכוכית היא פונקציונליות הראשון עם aminosilane, אשר יחד ואז מולקולות PEG biotinylated. ציפוי זה עוזר להפחית את האינטראקציות ספציפי של דנ"א וחלבונים שכפול עם המשטח ^1,3.

חומרים: coverslips זכוכית, צנצנות מכתים, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k-NHS אסתר, ביוטין, PEG5k-NHSester, אצטון, 1M KOH, אתנול תנור, sonicator Bath

1. ניקיון יסודי של coverslips זכוכית על ידי הצבת אותם מכתים צנצנות ממלאים את הצנצנות עם אתנול. Sonicate במשך 30 דקות ולשטוף את הצנצנות מתמלאות 1 M KOH. Sonicate במשך 30 דקות הן חזרו שוטף.
2. עבור התגובה functionalization הראשון, כל עקבות מים צורך להסיר. ממלאים את הצנצנות עם אצטון sonicate במשך 10 דקות. שוטפים את הצנצנות שוב עם אצטון.
3. הכן 2% v / v פתרון של מגיב silane ב אצטון. הוסף את הצנצנות מכתים ו להתסיס במשך 2 דקות. תגובה זו זוגות הקבוצה alkoxy של aminosilane כדי זכוכית, משאיר אמין תגובתי לשלב הבא צימוד. להרוות את התגובה עם עודף גדול של מים.
4. יבש coverslips ידי אפייה אותם 110 מעלות בתנור למשך 30 דקות.
5. הכן methoxy 50:1: תערובת ביוטין PEG ב 100 pH 8.2 mM NaHCO _3. כוון PEG w / v סביב 0.2% biotinylated.
6. פיפטה 100 μL של התערובת PEG על coverslip מקום silanized יבש אחר coverslip על העליונה. כולל spacer coverslip זכוכית תאפשר הפרדת coverslips.
7. דגירה coverslips בפתרון PEG במשך 3 שעות, ואז נפרד כל זוג coverslips בהרחבה ולשטוף עם מים. הקפד לשמור coverslips פונקציונליות כלפי מעלה כמו פעם רק צד יהיה מצופה PEG.
8. יבש coverslips ולאחסן תחת ואקום. משטחים להישאר יציב למשך חודש לפחות, כך עשרות coverslips ניתן לבצע אצווה בשימוש לפי הצורך.

חומרים אלה צריכים להיעשות מבעוד מועד, ולאחר מכן השתמשו עבור כל ניסוי. כדי להתחיל בניסוי כל מולקולה בודדת, להתחיל בהרכבת תא הזרימה.

3. לשכת תזרים הכנה

הניסוי מבוצע באמצעות תא זרימה פשוט בנוי עם coverslip פונקציונליות, פעמיים צדדי קלטת, שקופיות קוורץ צינורות. אחת קאמרית תזרים מוכן לכל מולקולה בודדת ^1,4 הניסוי.

חומרים: פעמיים צדדי קלטת, סכין גילוח, שקופיות קוורץ עם חורים אפוקסי, מהירה יבש צינורות, coverslip פונקציונליות (ראה לעיל), פתרון streptavidin (25 μL של 1 מ"ג / מ"ל PBS), צינורות, חיץ חסימה (20 mM טריס pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 מ"ג / מ"ל ​​BSA, 0.005% Tween-20)

1. בגין על ידי הנחת 20-25 מ"ל של חיץ חסימת ייבוש להסיר בועות אוויר עבור צעדים מאוחר יותר.
2. קחו coverslip PEG-פונקציונליות ולהפיץ 125 של פתרון PBS-בדילול streptavidin על פני השטח. תשאיר את זה דגירה במשך 20 דקות תוך כדי הכנת חלקים אחרים של התא, ומאפשר streptavidin להיקשר biotins פני השטח.
3. חותכים פיסת פעמיים בצדקלטת ד כדי להתאים את גודל השקופית קוורץ. סמן את המיקום של החורים בצינור בקלטת בעיפרון כך קווי המתאר של החדר תזרים ניתן להסיק בקלטת (1 מ"ג / מ"ל).
4. הכן 2 מ"מ רחב מלבן סביב החורים. זה ישמש ערוץ הזרימה, כדי להיות בטוח כדי להפוך את הצדדים ישר להשאיר מקום סביב כניסת צינורות מוצא. אם תרצה, או ערוצים מרובים בגדלים שונים ניתן להשתמש.
5. גזור לאורך קו המתאר נמשך, מה שהופך ישר, חתכים נקיים כדי לוודא שלא דבק הבולטת לתוך התעלה.
6. נקו את אצטון ביסודיות באמצעות קוורץ או אתנול להסיר דבק מן הבנייה תזרים הקודם התא.
7. מצא את ההיערכות הטובה ביותר המתאר את הערוץ, להסיר צד אחד של גיבוי דבק בזהירות במקום קלטת לשקופית קוורץ. היזהר ליישר את הקלטת כראוי, כמו החורים מפרצון ו לשקע צריכים להישאר חסומים.
8. גזור אורכי צינורות עבור כניסת ו לשקע של התא זרימה. זה עוזר לחתוך את הקצה של הצינור על כ 30 ° זווית כך הצינור לא לחוצים אל תחתית החדר. מניחים את הצינורות על איזה תמיכה להשעות אותם מצורף קל התא זרימה בשלבים הבאים.
9. שוטפים את coverslip streptavidin מצופים היטב במים ולייבש באמצעות אוויר דחוס. זכרו כי רק צד אחד הוא פונקציונליות; להיזהר לא להפוך את coverslip נגמר. הסר את הצד השני של קלטת גיבוי במקום שקופיות קוורץ על coverslip.
10. לחץ קלות על coverslip כדי לדחוף את כל האוויר שנלכד דבק. זה יעזור למנוע בועות אוויר להיכנס לערוץ הזרימה.
11. חותם את הצדדים של החדר עם אפוקסי. הכנס את צינורות לחתוך לתוך החורים של קוורץ ו חותם במקום עם אפוקסי. זה צריך להתייבש במשך כמה דקות.
12. יבש פעם, להתחיל לחסום את פני השטח על ידי משיכת חלק למאגר חסימת degassed דרך אחד הצינורות. מחט מד 21-מתאים באופן מושלם בתוך צינורות 0.76 מ"מ. פלאש כמה פעמים כדי להסיר בועות אוויר, ולאפשר החדר כדי לדגור במשך שעה לפחות חצי.

4. Single-מולקולה שכפול ניסוי

חומרים: תא תזרים הוכן, SYTOX אורנג', מיקרוסקופ TIRF, 532 ננומטר לייזר, מצלמת CCD, מחשב עם תוכנת רכישת התמונה, הרולינג מעגל המצע דנ"א, חלבונים שכפול

1. לאחר התא זרימה נחסם, הכל מוכן להתחיל את הניסוי יחיד מולקולה.
2. קח את התא זרימה ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ. החזק את תא במקום עם קליפים הבמה להיות בטוח כי ערוץ זרימה ממוקם ישר לאורך ציר ה-Y.
3. חבר את התא זרימה מוצא הצינור לשאוב את המזרק באמצעות מחבר צינורות בקוטר גדול יותר או מחט. מניחים את כניסת בחסימת המאגר ולמשוך את הבוכנה כדי להסיר כל האוויר בצינור. קפיצי עדין של הצינור לשקע יעזור ברור כל בועות אוויר שנלכדו בתוך התא זרימה.
4. לדלל את תבנית ה-DNA המניות PM ב 25 מ"ל 1 של חיץ חסימה. תזרים לתוך תא בקצב הזרימה מתונה לאפשר כיסוי השטח טוב של ה-DNA. 0.025 מ"ל / דקה במשך 30 דקות פועלת היטב. זו יכולה להיות מגוונת המבוססת על כמה מולקולות הדנ"א הן על פני השטח עבור כל אצווה של coverslips או כמה הם הרצויה עבור הניסוי.
5. לאחר ה-DNA הוא, לשטוף את ה-DNA העודף באמצעות חסימת חיץ. לשטוף לפחות 200 תזרים תאים כרכים להיפטר מה-DNA של כל תשלום.
6. בגין degassing החיץ שכפול. עבור א שכפול ניסויים coli, לעשות את זה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הסיכון של בועות בחדר מחומם לזרום.
7. הפעל את הלייזר ואת המצלמה. CCD מקורר צריך להגיע לטמפרטורת לפני שניתן יהיה להשתמש בו.
8. אם ביצוע הניסוי 37 ° C, להפעיל את החימום. הקפד המטרה היא במגע עם התא זרימה או שזה יהיה גוף הקירור מאוחר יותר.
9. אחרי כביסה degassing, התגובה יכולה להיות מוכנים. מערבבים נוקלאוטידים, DTT, ו SYTOX במאגר שכפול. לאחר מכן להוסיף החלבונים ומערבבים בעדינות.
10. תזרים את תערובת התגובה לתוך התא זרימה. זו מהירות הזרימה צריך להיות מספיק כדי למתוח dsDNA. עבור ערוץ 2 מ"מ רוחב 100 מיקרומטר, תזרים גבוה 0.04 mL / min עובד היטב.
11. אפשר זמן התערובת להיכנס לחדר ולהתחיל הדמיה. עצה טובה היא להעביר את שדה הראיה לצד הערוץ ולהתמקד בחומר דביק. פעולה זו תבטיח שאתה קרוב לפני השטח למיקוד.
12. התאמת כוח לייזר, להתמקד מיקרוסקופ, וזווית TIRF. שמור על צריכת חשמל נמוכה, כדי למנוע כל photocleavage של ה-DNA מוכתם. רוכשת ב 1-5 מסגרות / שנייה למשך מספר דקות, תלוי בקצב של שכפול הדנ"א. אם תרצה, לחזור כדי לקבל עוד מסלולי שכפול או לעבור לתחום חדש כדי לראות מולקולות יותר.
13. לאחר התגובה תערובת כמעט ריק, זה רעיון טוב לזרום חיץ יותר עם SYTOX לראות בתחומים אחרים של התצוגה. לוקח מספר תמונות של מולקולות שונות משוכפל מספק נתונים סטטיסטיים לקביעת processivity.

5. נציג תוצאות

מולקולות שכפול פעיל נתפסים בקלות כקווים הגוברת של ה-DNA מוכתם. בניסויים שלנו, זורם 25 PM המצע M13 נותן 100-1000 מולקולות 60x, בשדה 125 מיקרומטר x 125 מיקרומטר מבט (איור 1). ביצוע ניסויים שכפול באמצעות E. חלבונים coli replisome ב 37 ° C (ראה חומרים לפרטים נוספים) נותן מולקולות 5-50 שכפול לכל שדה הראיה. בריכוזים המקבילה של replisome T7, אשר יוזם על פני המצע ביעילות רבה יותר, אנו צופים> 70% של מולקולות בתוך לשכפל שדה. תנאים אלה תשואה צפיפות מוצר כל כך גבוה מולקולות בודדות שקשה לפתור ולנתח, אז הניסויים T7 מבוצעים בריכוזים חלבון נמוכה יותר.

ניתוח נתונים: כדי לקבל קצב נתונים, פשוט העלילה את נקודת הסיום של ה-DNA לעומת זמן לחשב את המדרון (איור 2). עבור processivity, לקבוע את האורך הכולל של ה-DNA. שני המספרים האלה יהיה צורך להמיר זוגות בסיסים. לפני ביצוע הניסוי, אתה צריך לדעת את גודל פיקסל של המצלמה בהגדלה הנכונה. עבור המרה basepair, אמידה טובה היא פשוט המרת מבוסס על אורך קריסטלוגרפיים של ה-DNA, 2.9 נ"ב / ננומטר. עם זאת, זרימה למינרית לא לגמרי למתוח את ה-DNA, כך כיול אורך ה-DNA יבוצעו על ידי לקיחת דנ"א באורך ידוע, למשל 48,502 bp λ DNA, הצמדתו התא זרימה עם אוליגו biotinylated ומדידת אורך SYTOX המוכתמת שלה את קצב הזרימה משמש הניסוי שכפול. קביעת מספר זוגות בסיסים / פיקסל יאפשר חישוב מדויק של שיעור שכפול processivities. לקיחת תמונות וסרטים רבים תספק מספר גדול של מולקולת המוצר, דבר המאפשר לתכנן של הפצות קצב processivity (איור 2) ^1.

איור 1: (מתוך המשחק 1.) קריקטורה) של assay מתגלגל מעגל השכפול. (SA, streptavidin). מובילים גדיל סינתזה מרחיב את הזנב המקשר את מעגל פני השטח. הזנב מומר dsDNA ידי פולימראז גדיל מפגרת ומתח על ידי זרימה למינרית.
ב) דוגמה שדה הראיה עם SYTOX כתום עירור 532 ננומטר. כתמים ניאון קטנים הם קשורים, שאינם משוכפלים מצעים. הערה אורך קיצונית של המוצרים ואת מספר גדול של מוצרים לכל שדה (כל תא מכיל זרימת> 5000 שדות כאלה).

איור 2: (עיבוד שופט 1.) A, b) Kymographs של מולקולות שכפול אופייני T7 (א) ו - E. (ב) coli ניסויים. ג) מסלולי Endpoint של מולקולות מ) A ו-B) זממו נגד הזמן. המסלולים מצוידים רגרסיה ליניארית כדי לקבל שיעורי שכפול. דוגמאות המוצגים הם 99.4 נ"ב s ^-1 ו - 467.1 bp s ^-1. ד) הפצות אורך שכפול של מוצרים, שיתאים עם דעיכה מעריכית יחיד להשיג processivity: 25.3 ± 1.7 kbp (T7), 85.3 ± 6.1 kbp (E. coli). ה) הפצות שיעור מסלולי מולקולה בודדת, מתאים עם Gaussians יחיד. אמצעי: 75.9 ± 4.8 נ"ב s ^-1 (T7), 535.5 ± 39 נ"ב s ^-1 (E. coli).

Discussion

אחת מלאה קריטי בוחנת את ההשפעה של הכתם, SYTOX אורנג', על חלבונים שכפול של עניין. דרך פשוטה לעשות זאת היא לבצע את הניסוי שכפול התא זרימה כמתואר אבל עם השמטה של ​​SYTOX. לאחר תערובת תגובה יש זרמו החדר, להוסיף למאגר עם SYTOX להכתים דנ"א לבחון את חלוקת האורך של מולקולות משוכפל. לחלופין, תגובות בתפזורת סטנדרטי יכול לשמש כדי לבדוק השפעה כלשהי על שיעור של SYTOX שכפול ויעילות.

הניסוי המתואר כאן משתמשת רק ערוץ זרימה אחת. ניתן לשנות זאת בקלות על ידי יצירת רב ערוצי הזרימה לתאי או באמצעות PDMS או מכשירים microfluidic דומה. הגדלת מספר ערוצי מאוד מקל ההקרנה של ריכוזי חלבון, מוטציות, או מולקולות מעכב ומגבירה את המהירות של אוסף שכפול נתונים.

כאמור, אנו מבצעים את ה שכפול coli ניסויים ב 37 ° C באמצעות בית בנוי תזרים אלומיניום תא החימום, גוף חימום התנגדות (דוד מחסנית) ואת אספקת החשמל משתנה. זה נותן יציבות טמפרטורה טובה ומונע את רכישת מחמם אובייקטיבי. כדי לכייל את דוד, אנחנו פשוט קדח חור במרכז התא העליון תזרים קוורץ, תרמי מוכנס לתוך התעלה תזרים זרמו חיץ כרגיל. מדידת טמפרטורת התא זרימה חיץ במתח הגובר מאפשר חימום מדויק.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 ssDNA	New England Biolabs	N4040
Biotinylated Tail Oligo	Integrated DNA Technologies
T7 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0274	Use T7 replication buffer for substrate preparation
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform	Roche Group	03117987001	24:24:1 v/v
3-aminopropyl-triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG	Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS	Nektar
Double-sided tape	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide	Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing	BD Biosciences	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix	New England Biolabs	N0447
Ribonucleotide triphosphate solutions	Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange	Invitrogen	S11368	Other dsDNA stain can be used
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective	Olympus Corporation	IX-71	Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment
Syringe Pump	Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
532 nm laser	Coherent Inc.	Compass 215M-75	Select wavelength to correspond to stain of choice
EMCCD Camera	Hamamatsu Corp.	ImagEM
Emission filter	Chroma Technology Corp.	HQ600/75m
T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.51,5. E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6
E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6