蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

Summary

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。

Abstract

我々は、単一分子レベルでのDNA複製を観察するためのシンプルな蛍光顕微鏡ベースのリアルタイム方法を説明します。環状、分岐したDNAテンプレートは、官能ガラスのカバースリップに結合し、複製タンパク質とヌクレオチド（図1）の導入後に広範囲に複製されます。成長している製品の二本鎖DNA（dsDNAが）層流で拡張し、インターカレート色素を用いて可視化される。リアルタイムで成長しているDNAの端の位置を測定することにより、レプリケーションの速度（図2）を正確に決定することができます。さらに、完成したDNA産物の長さは複製のprocessivityに報告します。この実験は非常に容易かつ迅速に実施し、合理的に高感度カメラでのみ蛍光顕微鏡を必要とすることができます。

Protocol

単一分子の複製の実験を行う前に、いくつかの材料は、事前に準備する必要があります。

1。 DNA複製のテンプレート

複製反応の基質は、標準的な分子生物学技術の^1,2を用いて調製したビオチン化、両側M13ローリングサークルです。

材料：M13mp18一本鎖DNA、ビオチン尾のオリゴヌクレオチドプライマー（5' -ビオチン- T ₃₆ AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT - 3'）、T7 DNAポリメラーゼ、ヒートブロック、アミルフェノール/アルコール/クロロホルム

1. TBSバッファー（330 nMの尾オリゴ、33 nMのM13）のオリゴの10倍過剰を追加することでM13にビオチン尾オリゴをアニール。
2. 混合物に65℃のヒートブロックで加熱する。一度加熱し、ヒートブロックをオフにし、徐冷が適切にプライマーをアニールすることができます。
3. 64 nMのT7 DNAポリメラーゼやdNTPおよびMgCl _2を含有_する T7レプリケーションバッファの混合物にプライミングM13を追加。
4. 12分間37℃で反応をインキュベートし、100mMのEDTAで急冷。
5. 精製記入済みの製品のDNAフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出し、TE緩衝液または他の適切な保存バッファーに透析し、DNA濃度（M13をプライム、残留を回復するために、各有機相を逆抽出）を決定した。
6. テンプレートの準備の1回の繰り返しは容易に単一分子実験の数百〜数千のために十分な、ナノモル濃度のテンプレートのいくつかのミリリットルを行うことができます。

2。官能化されたカバーグラス

ガラスのカバースリップにDNAを取り付けるために、ガラスはまずビオチン化PEGの分子に結合されてアミノシラン、で官能れる。このコーティングは、表面^1,3とDNAと複製タンパク質の非特異的な相互作用を低減することができます。

材料：ガラスのカバーガラス、染色瓶、3 -アミノプロピルトリエトキシシラン、メトキシPEG5k - NHSエステル、ビオチン- PEG5k - NHSester、アセトン、1M KOH、エタノール、オーブン、バス音波処理

1. jarファイルを染色し、エタノールで瓶を充填に配置することにより、ガラス製カバースリップを徹底的に清掃してください。 30分間超音波洗浄し、瓶を洗浄し、1 M KOHで埋める。両方の洗浄を繰り返して30分間超音波洗浄器にかけます。
2. 第一機能化反応の場合は、水のすべての痕跡を削除する必要があります。 10分間アセトンと超音波処理してjarを埋める。アセトンで再びjarをすすいでください。
3. アセトンでシラン試薬の2％v / v溶液を準備します。染色瓶に追加し、2分間振とうする。この反応は、カップルガラスにアミノシランのアルコキシ基を、次のカップリングステップの反応性アミンを残して。水の大過剰の反応をクエンチ。
4. 110℃で30分間オーブンで焼成することによってカバースリップを乾かします。
5. 100mMのNaHCO _3で pHを8.2にビオチンPEGの混合物：50:1メトキシを準備します。約0.2％w / vのビオチン化PEGを目指す。
6. 乾燥したシラン化カバースリップと場所の上に別のカバースリップ上にPEG混合物の100μL添加します。ガラスのカバースリップのスペーサーを含めると、カバースリップの分離が可能になります。
7. 3時間のPEG溶液中でカバーグラスをインキュベートし、カバーガラスの各ペアを分離し、水で広範囲に洗ってください。一度だけの側として側を上に官能カバースリップがPEGでコーティングされるように十分注意してください。
8. 真空下でカバースリップとストアを乾かします。表面は、少なくとも月には安定なので、カバースリップの数十はバッチで行われ、必要に応じて使用することができます。

これらの材料は、事前に行われ、その後、各実験に使用する必要があります。すべての単一分子実験を開始するには、フローチャンバーを組み立てることから始めます。

3。フローチャンバーの準備

実験は、官能カバー、両面テープ、石英スライドとチューブで構成されたシンプルなフローチャンバーを使用して実行されます。つのフローチャンバーは、それぞれの単一分子実験^1,4のために準備されます。

材料：両面テープ、レーザーブレード、チューブ、クイックドライエポキシ用の穴を持つ石英スライド、官能カバースリップ（上記参照）、ストレプトアビジン溶液（PBS中の1 mg / mLの25μL）、チューブ、ブロッキング緩衝液（20mMトリスpH7.5、2mMのEDTA、50mMのNaCl、0.2 mg / mLのBSA、0.005％のTween - 20）

1. 後の手順については、気泡を除去するデシケーター中でブロッキングバッファーの20-25 mLを置くことによって始めます。
2. 表面上のPBSに希釈したストレプトアビジン液のPEG -官能化されたカバースリップと広がり125を取る。ストレプトアビジンは、表面のビオチンを結合させること、チャンバーの他の部分を準備しながら20分間インキュベートするために、このままにしておきます。
3. ダブルサイドの部分をカットdは、テープ石英スライドのサイズを一致させる。フローチャンバーの概略をテープ（1 mg / ml）の上に描画できるように、鉛筆とテープ上のチューブの穴の位置をマークします。
4. 穴の周囲2mmの幅の長方形を作る。これは、流路として機能するので、チューブの入口と出口の周りにストレート側面を作り、部屋を出るようにしてください。必要に応じて、複数のチャネルまたは異なるサイズを使用することができます。
5. チャンネルに無接着剤突出していることを確認してまっすぐ、きれいな削減を行って、描かれた輪郭に沿ってカット。
6. 徹底的に前のフローセルの構造から接着剤を除去するためアセトンまたはエタノールを用いて石英を清掃してください。
7. チャンネルの概略の最高のアラインメントを見つける、粘着の片側を取り外し、慎重に石英スライドの上にテープを配置。入口と出口の穴がブロック解除を維持する必要があるとして、適切にテープを揃えるように注意してください。
8. フローセルの入口と出口のためにチューブの長さをカット。それは、チューブがチャンバーの底部に対して平らに押ししないように約30 °の角度でチューブの端をカットするのに役立ちます。次のステップでフローセルに簡単に添付ファイルのためにそれらを中断するためのサポートのいくつかの並べ替えにチューブを置きます。
9. 水で十分ストレプトアビジンでコートしたカバースリップをリンスし、圧縮空気を用いて乾燥させる。片側のみに官能されていることを思い出してください。カバーを裏返しにしないように注意してください。テープの裏の反対側を外し、カバーグラスの上に石英スライドを配置。
10. 軽く接着剤に閉じ込められた空気を押し出すためにカバースリップを押してください。これは、流路に入る気泡を防ぐことができます。
11. エポキシ樹脂とチャンバーの両側をシール。エポキシ樹脂と場所の石英とシールの穴にカットチューブを挿入します。これには数分間乾燥させる必要があります。
12. 一度乾燥、真空管のいずれかを使用して脱気ブロッキングバッファーの一部を引っ張って表面をブロッキングを開始。 21ゲージの針は0.76 mmのチューブの内部に完全に適合しています。気泡を除去するために数回はフラッシングを行ってください、とチャンバーは少なくとも半時間インキュベートすることができます。

4。単一分子の複製実験

材料：準備されたフローチャンバー、SYTOXオレンジ、全反射顕微鏡、532nmのレーザー、CCDカメラ、画像取得ソフトウェアとコンピュータ、ローリングサークルDNA基質、複製タンパク質

1. フローセルがブロックされた後、すべてが単一分子実験を開始する準備が整いました。
2. フローセルを取ると、顕微鏡のステージ上に置きます。ステージのクリップのある場所でチャンバーを持ち、流路が直線y軸に沿って配置されていることを確認してください。
3. より大きな直径のコネクタチューブや注射針を使用してシリンジポンプにフローセルの出口管を接続します。ブロッキング緩衝液で口を配置し、チューブ内の空気を除去するために注射器を後方に引いて。出口管の穏やかな映画は、フローセル内に閉じ込められた気泡をクリアするのに役立ちます。
4. ブロッキング緩衝液1mLに25午後の株式DNA鋳型を希釈する。 DNAの良好な表面被覆率を可能にするために適度な流量でチャンバーに流入。 30分間0.025 mL / minではうまく動作します。これは、カバースリップまたはどのように多くの実験のために望まれているのバッチごとに表面にどのように多くのDNA分子に基づいて変化させることができる。
5. DNAがになると、ブロッキング緩衝液を使用して余分なDNAを洗浄。すべての遊離DNAを取り除くために少なくとも200フローセルボリューム用洗浄する。
6. レプリケーションバッファを脱始める。 E.用大腸菌の複製実験、37℃でこれを行う° C加熱されたフローチャンバーで泡のリスクを軽減する。
7. レーザーとカメラの電源を入れます。冷却CCDは、それが使用できる前に温度に到達する必要があります。
8. 37℃の実験を行う場合、上ヒーターの電源を入れます。目的は、フローセルに接触しているか、後でヒートシンクになることを確認してください。
9. 洗濯して脱気した後、反応を調製することができる。ミックスヌクレオチド、DTT、およびレプリケーションのバッファにSYTOX。その後、タンパク質を加え、穏やかに混合する。
10. フローセルに反応混合物を流し込む。この流れの速度は、dsDNAを伸ばすのに十分である必要があります。 2 mm幅、100μmの背の高い流路の場合は0.04 mL / minではうまく動作します。
11. 混合チャンバーを入力し、イメージングを開始するための時間を確保します。良いヒントは、チャネルの側面に視野を移動し、接着剤に焦点を当てることです。これは、収束するための表面の近くにあるようにします。
12. レーザパワー、顕微鏡のフォーカス、および全反射の角度を調整します。ステンドDNAの任意のphotocleavageを避けるために、低消費電力を維持する。 DNA複製の速度に応じて、数分間の手順1-5フレーム/秒で取得する。必要に応じて、より長いレプリケーション軌跡を得る以上の分子を見るために新しいフィールドに移動するには繰り返す。
13. 反応混合物がほとんど空になった後、それはSとより多くのバッファに流れるように良いアイデアです。ビューの他のフィールドを参照するYTOX。別の複製された分子の複数の画像を取ることはprocessivityの決定のための統計情報を提供します。

5。代表的な結果

積極的に複製する分子が容易に染色されたDNAの成長線として見られている。我々の実験では、M13基板25 PMを流れると、ビューの60倍、125μmの× 125μmのフィールド（図1）で100から1000までの分子を与える。 E.を使用して、レプリケーションの実験を行う37 ° C（詳細は資料を参照）で大腸菌 replisomeタンパク質は、視野当たり50から50を複製する分子が得られます。はるかに効率的に基板上に開始するT7 replisome、同等の濃度では、我々はフィールドの複製の分子の> 70％を観測。これらの条件は、個々の分子が解決し、分析することが困難であることが非常に高く、製品の密度を得るため、T7の実験は、より低いタンパク質濃度で実行されます。

データ解析：率のデータを取得するには、単にDNA対時間のエンドポイントをプロットし、傾き（図2）を計算する。 processivityの場合は、DNAの全長を決定する。これらの数字の両方が塩基対に変換する必要があります。実験を行う前に、適切な倍率でカメラのピクセルサイズを知っている必要があります。塩基対の変換、良好な推定のために単に2.9 BP / NM、DNAの結晶長さに基づいて変換しています。しかしながら、層流が完全にDNAを伸ばししません、DNAの長さのキャリブレーションは、既知の長さのDNA、例えば、48502 bpのλDNAを取ってビオチン化オリゴとフローセルに装着し、で、そのSYTOX染色した長さを測定することによって実行する必要がありますので、複製の実験に使用する流量。塩基対/ピクセルの数を決定する複製率とprocessivitiesの正確な計算が可能になります。多数の画像や動画を取ることは速度とprocessivity分布（図^2）1のプロットできるように、製品の分子の多数を提供します。

図1：（文献から1。）ローリングサークル複製アッセイの）漫画。 （SA、ストレプトアビジン）。リーディング鎖合成は、円と表面を結ぶ尾を拡張します。尾は、ラギング鎖のポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、層流によって引き伸ばされている。
SYTOXオレンジと532nmの励起とビューのb）の例のフィールド。小さな蛍光スポットが繋留、非レプリケート基質である。製品の極端な長さと、フィールドごとの製品（各フローセル> 5000そのようなフィールドを含む）の数が多いことに注意してください。

図2：T7（）とEからの典型的な複製の分子の（。文献から適応1）、b）のKymographs 大腸菌 （b）の実験。 C））とb）から分子のエンドポイントの軌跡は、時間に対してプロット。軌道は、レプリケーションの速度を得るために線形回帰が取り付けられています。示した例は99.4塩基対s ^-1とし、467.1 bpのs ^-1となります。 D）長さレプリケーション製品のディストリビューション、processivityを得るために、単一の指数関数的減衰に合う：25.3 ± 1.7 kbpの（T7）、85.3 ± 6.1 kbpの（ 大腸菌 ）。 e）は、単一の分子軌道の速度分布は、単一ガウス分布でフィット。手段：75.9 ± 4.8 BPの^{-1（T7）、535.5} ± 39 BP s ^-1の（ 大腸菌 ）。

Discussion

一つの重要な制御は、関心の複製蛋白質で、汚れ、SYTOXオレンジの効果を検討している。これを行う簡単な方法は、前述のようにフローセルではなくSYTOXの省略を使用したレプリケーションの実験を行うことです。反応混合物は、チャンバを通って流入した後、DNAを染色し、複製された分子の長さの分布を調べるためにSYTOXでバッファを追加します。また、標準的なバルクの反応は、レプリケーションの速度と効率上SYTOXの任意の効果を確認するために使用することができます。

ここで説明する実験は、単一の流路を使用しています。これは、マルチチャネルのフローチャンバーを作成またはPDMSまたは類似のマイクロ流体デバイスを用いて容易に変更することができます。チャネルの数を増やすと、大幅にタンパク質濃度、変異体、または阻害剤の分子のスクリーニングを容易にし、レプリケーションデータ収集の迅速性を向上させます。

前述のとおり、我々はE.を行います37 大腸菌の複製実験° C、自作アルミフローセルのヒーター、抵抗加熱要素（カートリッジヒーター）と可変電源を使用する。これにより、良好な温度安定性を与え、客観的なヒーターの購入を避けることができます。ヒーターを校正するために、我々は、単に、石英フローセルの上部の中央に穴をあけ流路に熱電対を挿入し、通常どおりバッファを流れた。増加する電圧でフローセルのバッファの温度を測定することは、正確な加熱が可能になります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 ssDNA	New England Biolabs	N4040
Biotinylated Tail Oligo	Integrated DNA Technologies
T7 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0274	Use T7 replication buffer for substrate preparation
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform	Roche Group	03117987001	24:24:1 v/v
3-aminopropyl-triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG	Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS	Nektar
Double-sided tape	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide	Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing	BD Biosciences	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix	New England Biolabs	N0447
Ribonucleotide triphosphate solutions	Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange	Invitrogen	S11368	Other dsDNA stain can be used
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective	Olympus Corporation	IX-71	Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment
Syringe Pump	Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
532 nm laser	Coherent Inc.	Compass 215M-75	Select wavelength to correspond to stain of choice
EMCCD Camera	Hamamatsu Corp.	ImagEM
Emission filter	Chroma Technology Corp.	HQ600/75m
T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.51,5. E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6
E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6