Summary
Stereomicroscope तहत वयस्क माउस से दांतेदार गाइरस को हटाने के लिए एक विच्छेदन तकनीक वीडियो दर्ज की इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया गया.
Protocol
Hippocampal दांतेदार गाइरस के विच्छेदन
- एक गहरी anesthetized माउस में, ध्यान से मस्तिष्क काटना खोपड़ी से बाहर है और यह बर्फ ठंड फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में जगह.
- बहुत ठंडा पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में, मस्तिष्क एक सर्जिकल चाकू का उपयोग कर के अनुदैर्ध्य विदर के साथ मस्तिष्क में कटौती, और बंद लैम्ब्डा के लिए पीछे क्षेत्रों (midbrain, hindbrain, और सेरिबैलम) में कटौती.
- मस्तिष्क गोलार्द्ध औसत दर्जे की ओर रखें और संदंश का उपयोग करने के लिए, ध्यान से एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे diencephalon (thalamus और hypothalamus) को हटा दें. इस हिप्पोकैम्पस के औसत दर्जे का पक्ष का पर्दाफाश, दांतेदार गाइरस के दृश्य के लिए अनुमति होगी. दांतेदार गाइरस अम्मोनियों सींग से उन दोनों के बीच अंतराल के द्वारा अलग पहचाना है. हिप्पोकैम्पस या आसपास के क्षेत्र के लिए चोट इसे और अधिक कठिन दांतेदार गाइरस को अलग करने के लिए कर देगा.
- दांतेदार गाइरस (दांतेदार गाइरस और अम्मोनियों के सींग की सीमाओं, चित्रा 1) के प्रत्येक पक्ष में एक तेज सुई की नोक (जैसे, 27 गेज सुई) डालें, और सुई अल्पज्ञता हिप्पोकैम्पस के अक्ष septo लौकिक के साथ अलग करने के लिए स्लाइड दांतेदार गाइरस.
- पृथक दांतेदार एक सुई या संदंश का उपयोग गाइरस उठाओ और यह एक नमूना ट्यूब में जगह है. इस प्रकार प्राप्त दांतेदार गाइरस ऊतक नमूना किसी भी परख के लिए तुरंत इस्तेमाल कर सकते हैं या बाद में उपयोग के लिए एक गहरे फ्रीजर में संग्रहीत.
- उसी पद्धति का उपयोग करके अन्य मस्तिष्क गोलार्द्ध से दांतेदार गाइरस पृथक.
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर
दांतेदार गाइरस उपर्युक्त विधि और शेष हिप्पोकैम्पस अम्मोनियों जंगली प्रकार चूहों से सींग नमूना के रूप में dissected किया गया था का उपयोग कर पृथक किया गया. वास्तविक समय पीसीआर बीटा actin, TDO2, डीएसपी, Mrg1b और Tyro3 के दांतेदार गाइरस और अम्मोनियों के सींग के नमूने के रूप में एक पहले से वर्णित के साथ प्रदर्शन किया गया. 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG प्राइमर्स और 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC Mrg1b, और GCCTCCAAATTGCCCGTCA और 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA के लिए Tyro3 के लिए इस्तेमाल किया गया.
माइक्रोएरे विश्लेषण
(- चूहों अल्फा CaMKII + /) के रूप में एक पहले से वर्णित माइक्रोएरे प्रयोगों पुरुष जंगली प्रकार चूहों और कैल्शियम / calmodulin पर निर्भर प्रोटीन kinase द्वितीय के अल्फा isoform के लिए विषमयुग्मजी चूहों के साथ प्रदर्शन किया गया. संक्षेप में, पूरे या जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों के दांतेदार गाइरस हिप्पोकैम्पस से अलग शाही सेना एक माउस जीनोम 430 2.0 ऐरे (Affymetrix, सांता क्लारा, CA) के साथ संकरित किया गया था, और प्रत्येक GeneChip Affymetrix GeneChip 3000 स्कैनर (GCS3000) द्वारा स्कैन किया गया था . GeneChip विश्लेषण माइक्रोएरे विश्लेषण सूट संस्करण 5.0 के साथ प्रदर्शन किया था.
Discussion
दांतेदार गाइरस hippocampal 2,3 गठन की मात्रा का लगभग 25% से 30% रह रहे हैं. यह एक अद्वितीय सेल संरचना है और विभिन्न मस्तिष्क कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसलिए, तकनीक दांतेदार गाइरस अलग घटनाओं है कि इस क्षेत्र में विशेष रूप से पाए जाते हैं विश्लेषण करने के लिए उपयोगी होते हैं.
यहाँ, हम एक प्रक्रिया करने के लिए कुशलतापूर्वक वयस्क माउस हिप्पोकैम्पस से दांतेदार गाइरस काटना प्रदर्शन किया और तकनीक की शुद्धता की पुष्टि की. सबसे पहले, histologic अध्ययन से पता चला है कि दांतेदार गाइरस अन्य क्षेत्रों द्वारा संदूषण (चित्रा 1) के बिना अलग हो गया था, यह दर्शाता है कि एक शुद्ध दांतेदार गाइरस नमूना तैयार किया जा सकता है.
दूसरा, हम पुष्टि की है कि dissected ऊतक दांतेदार गाइरस विशिष्ट जीन, TDO2 और डीएसपी, और अम्मोनियों के सींग समृद्ध जीन, Mrg1b और Tyro3 4 (चित्रा 2) के वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आयोजित दांतेदार गाइरस है. TDO2 के mRNA अभिव्यक्ति (= 0.०,००,०२३ पी, है n = 4 और 4, क्रमशः) और डीएसपी (= ०.००,००,०३० पी, है n = 4 और 4, क्रमशः) दांतेदार गाइरस नमूनों में स्पष्ट रूप से उच्च स्तर पर पाया गया है, जबकि Mrg1b (पी = 0.000080; है n = 4 और 4, क्रमशः) और Tyro3 (पी = ०.००,०१७; है n = 4 और 4, क्रमशः) अम्मोनियों के सींग के नमूनों में उन लोगों की तुलना में निचले स्तर पर थे. बीटा actin अभिव्यक्ति के स्तर को इन नमूनों में अलग नहीं किया था (= 0.11 पी; पता क्रमशः = 4 और 4). इस प्रकार, हम जाँच कर सकता है चाहे या नहीं दांतेदार गाइरस सही में सरल वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों द्वारा आयोजित बाहर dissected था.
तीसरा, इस विच्छेदन पद्धति की उपयोगिता का आकलन करने के लिए, हम दांतेदार गाइरस के साथ कि पूरे हिप्पोकैम्पस के mRNA अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में. पूरे हिप्पोकैम्पस और दांतेदार गाइरस है पता क्रमशः 9 = और 4, जंगली - प्रकार और अल्फा - CaMKII + / से प्राप्त - चूहों (है पता 18 = और 4, क्रमशः) माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए संसाधित थे, और के लिए सभी जीनों रन बनाए, गुना - परिवर्तन जंगली प्रकार मूल्य द्वारा उत्परिवर्ती मूल्य विभाजित करके गणना की थी. परिणाम संकेत दिया कि mRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन, डीएसपी और TDO2 जैसे दांतेदार विशिष्ट - गाइरस अणुओं की विशेष रूप से, के साथ पाया गया दांतेदार गाइरस नमूनों में संवेदनशीलता में एक 5 गुना पूरे hippocampal नमूने (1 टेबल) की तुलना में वृद्धि हुई है. हम पहले दिखा दिया कि अल्फा CaMKII + / - चूहों एक्ज़िबिट व्यवहार काम स्मृति घाटे और एक अतिरंजित infradian 1,5 ताल के रूप में मानव मानसिक विकारों से संबंधित है. इसके अलावा, उत्परिवर्ती चूहों में दांतेदार गाइरस न्यूरॉन्स के शब्द के भागों और electrophysiologic सुविधाओं strikingly अपरिपक्व सामान्य कृन्तकों में दांतेदार गाइरस न्यूरॉन्स के उन लोगों के लिए समान हैं, यह दर्शाता है कि इन उत्परिवर्ती चूहों में न्यूरॉन्स 1 परिपक्वता को विकसित करने में विफल. अपरिपक्व डीएसपी के दांतेदार गाइरस और नीचे विनियमित अभिव्यक्ति और अल्फा CaMKII TDO2 mRNA + / - चूहों लग रहा है कि डीएसपी और TDO2 दांतेदार गाइरस (Ohira एट अल में परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संगत कर रहे हैं, अप्रकाशित. डेटा).
साथ में ले ली, इस सुविधाजनक और सटीक विच्छेदन तकनीक मज़बूती दांतेदार गाइरस पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दांतेदार गाइरस इस पद्धति का उपयोग करने के लिए प्राप्त ऊतक विश्लेषण के प्रोटिओमिक और कोशिका जीव विज्ञान के विश्लेषण सहित अन्य प्रकार के रूप में अच्छी तरह से, के लिए लागू है.
चित्रा 1 histologic अध्ययन द्वारा पृथक दांतेदार गाइरस का सत्यापन. दांतेदार गाइरस अलग करने के बाद मस्तिष्क का राज्याभिषेक अनुभाग Nissl धुंधला (बाएं पैनल) के लिए संसाधित किया गया था, और एक योजनाबद्ध माउस मस्तिष्क atlas6 से अनुकूलित आरेख बाईं पैनल (सही पैनल) में दिखाया गया है अनुभाग के लगभग एक ही स्तर का प्रतिनिधित्व करता है. तीर सम्मिलन सुई की नोक के निर्देशों से संकेत मिलता है. स्केल बार, 1 मिमी.
चित्रा 2 वास्तविक समय पीसीआर द्वारा पृथक दांतेदार गाइरस का सत्यापन. दांतेदार गाइरस और अम्मोनियों सींग की चार जंगली प्रकार चूहों से प्राप्त बीटा actin के वास्तविक समय पीसीआर, TDO2, डीएसपी, Mrg1b और Tyro3 के लिए प्रोसेस किया गया. परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं के रूप में ± SEM मतलब है. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, छात्र टी परीक्षण नियोजित किया गया था और पी मूल्यों का पालन कर रहे हैं: बीटा actin, पी = 0.11; TDO2, पी .०,००,०२३ = (1 **); डीएसपी, (2 ** .००,००,०३० = पी) , Mrg1b, पी = 0.000080 (** 3), और Tyro3, पी = (4 ** ०.०००१७).
तालिका 1. पूरे हिप्पोकैम्पस और दांतेदार गाइरस के माइक्रोएरे विश्लेषण जीन विभिन्न दांतेदार गाइरस और अल्फा CaMKII के पूरे हिप्पोकैम्पस में व्यक्त + / - चूहों जंगली प्रकार चूहों में पता चला है कि से गुना परिवर्तन की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया है. चूहों - डेटा सांख्यिकीय जंगली प्रकार और अल्फा CaMKII + / के बीच छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर के महत्व के लिए विश्लेषण किया गया. जीन के अलावा जिनकी अभिव्यक्ति <0.05 पी में प्रदर्शितअल्फा CaMKII + / दांतेदार गाइरस - कि जंगली प्रकार चूहों की तुलना में चूहों, शीर्ष 50 जीनों सूचीबद्ध हैं. ध्यान दें कि दांतेदार गाइरस के लिए नमूनों की संख्या पूरे हिप्पोकैम्पस के लिए उन लोगों की तुलना में बहुत कम हैं. AffyID, Affymetrix जांच पहचानकर्ता, CKII, अल्फा CaMKII + / - चूहों, WT, जंगली प्रकार चूहों.
| दांतेदार गाइरस (पी <0.05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | पूरे हिप्पोकैम्पस WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| जीन शीर्षक | Genebank | AffyID | मोड़ो परिवर्तन | पी मूल्य | मोड़ो परिवर्तन | पी मूल्य | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | ०.०१,१०,१८,९१३ | 7.02694E - 06 | ०.०३७०२१००३ | 1.86126E - 13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0.०१,४३,६९,७३४ | 7.86747E - 06 | 0.04232106 | 1.00579E - 12 | ||
| 2,3-dioxygenase tryptophan | AI098840 | 1419093_at | .०२०९८६४८४ | 5.23546E - 09 | 0.१०१०३७७७६ | 4.14823E - 13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | ०.०७,५४,७९,९०१ | 1.05191E - 08 | 0.२३४००११५४ | 1.66301E - 15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0.०७९४५७७६७ | 1.40433E-07 | ०.१७,७९,७४,७१५ | 3.9758E-12 | ||
| thyrotropin हार्मोन रिसेप्टर रिहा | M59811 | 1449571_at | 0.१०३१०५८१५ | .००३०९३७९६ | ०.८०,१४,१२,७३२ | .२८,३९,९४,३६१ | ||
| ryanodine 1 रिसेप्टर, कंकाल की मांसपेशी | X83932 | 1427306_at | .१०४८२५५१७ | 3.38513E-07 | 0.६५०६८५०१७ | 0.०००३०८४६२ | ||
| अनभिज्ञा हेलिक्स पाश एक हेलिक्स | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4.078815314 | 5.27E-11 | ||
| copine परिवार के सदस्य ग्यारहवीं | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E - 06 | 1.797304153 | 0.००,०२,९६,३७५ | ||
| doublecortin तरह तीन kinase | BB326709 | 1436532_at | ०.१०,९३,३६,६६२ | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E - 08 | ||
| 3 calpain | AF127766 | 1426043_a_at | 0.१११२६९७६९ | 8.07053E - 06 | .३७,०९,५६,६०८ | 2.04421E - 14 | ||
| वयस्क पुरुष कोष striatum सीडीएनए, पूर्ण लंबाई आरआईकेईएन समृद्ध पुस्तकालय, क्लोन: C030023B07 उत्पाद: unclassifiable, पूर्ण डालने अनुक्रम | BB357628 | 1460043_at | ०.११,८७,१२,३४१ | 6.16926E-07 | ०.६८,२३,३९,२०४ | 2.33001E - 06 | ||
| कोलेजन और कैल्शियम बाध्यकारी EGF एक डोमेन | AV264768 | 1437385_at | 0.१२४०४३९७८ | 3.65669E-05 | 0.४८८३९४११२ | 4.05538E - 06 | ||
| (A4) amyloid प्रोटीन अग्रदूत बाध्यकारी, परिवार के एक सदस्य 2 बंधनकारी प्रोटीन बीटा | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2.099164713 | 1.67047E - 06 | ||
| calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | .१३,०२,५५,४४४ | 3.32186E - 06 | .५७२६०५७५१ | 1.99157E - 10 | ||
| लिखित ठिकाना | AV328597 | 1443322_at | ०.१३,३२,९०,८३५ | 5.43583E - 06 | ०.५६२७६७१६४ | 7.56544E - 06 | ||
| neuropeptide वाई रिसेप्टर Y2 | NM_008731 | 1417489_at | .१३५३१९६०९ | ०.०००११३४०७ | .७८,१४,९८,४७४ | 0.00394504 | ||
| रास उत्तरदायी तत्व बंधनकारी प्रोटीन 1 | BE197381 | 1428657_at | 0.१३,८२,३५,११४ | 7.93691E-07 | ०.६५१२२०७०५ | 2.94209E-05 | ||
| glial सेल लाइन neurotrophic कारक परिवार रिसेप्टर व्युत्पन्न अल्फा 2 | BB284482 | 1433716_x_at | ०.१३९०६२५६३ | 2.35371E - 06 | .६६९५४४७०९ | ०.०००२१४१४६ | ||
| 1 preproenkephalin | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E - 08 | 1.766018828 | .००,०२,५०,५०१ | ||
| आरआईकेईएन सीडीएनए 1810010H24 जीन | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E - 09 | ||
| ryanodine 1 रिसेप्टर, कंकाल की मांसपेशी | BG793713 | 1457347_at | .१५,१३,६४,२९२ | 3.35612E-05 | ०.५०,३१,४४,६१७ | 4.32907E-05 | ||
| 21 protocadherin | NM_130878 | 1418304_at | .१५,२६,७१,८४९ | 8.57783E - 06 | 0.६७०७१४७२६ | 1.56309E-05 | ||
| cornichon 3 homolog (ड्रोसोफिला) | NM_028408 | 1419517_at | .१५३७२४१४४ | 8.90755E - 06 | 0.95780695 | 0.६६१०५५६०८ | ||
| harakiri, BCL2 बातचीत प्रोटीन (केवल BH3 डोमेन शामिल हैं) | BQ175572 | 1439854_at | ०.१५,४२,८४,४०७ | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E - 09 | ||
| कार्बोहाइड्रेट (एन acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | ०.१५,५२,३८,९५१ | 5.37423E - 06 | 1.14910007 | .२१,५६,३७,७३३ | ||
| 3 calpain | AI323605 | 1433681_x_at | 0.१६,०८,७१,९८८ | 1.07655E-05 | 0.४७७१६४७५७ | 1.33753E - 11 | ||
| जस्ता उंगली, CCHC 5 युक्त डोमेन | BQ126004 | 1437355_at | .१६१८१२०७८ | 3.08262E - 06 | 0.४२,१२,५२,६३२ | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | .१६५१२९९६७ | 1.86362E-05 | 0.६३,९७,३३,४०९ | 0.०००७२९७७२ | ||
| 1 spondin, (च spondin) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन | BC020531 | 1451342_at | 0.१६८०३५८७९ | 6.67867E-07 | ०.८२१०४२४१२ | 0.०२३६५०७६५ | ||
| आरआईकेईएन सीडीएनए जीन A930035E12 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1.470383201 | ०.१०,४०,८५,४५४ | ||
| BB247294 आरआईकेईएन पूर्ण लंबाई समृद्ध, 7 दिनों नवजात शिशु सेरिबैलम मुसलमानों मस्कुलस सीडीएनए क्लोन A730018G18 3 ', mRNA अनुक्रम. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1.968147585 | 0.00010636 | ||
| FERM डोमेन 3 युक्त | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | ०.००,०३,४५,५८१ | 2.780297178 | 1.83072E - 06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E - 06 | 2.652516957 | ०.००,०२,०६,२७९ | |||
| लिखित दृश्यों | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1.296248831 | 0.22870031 | ||
| 1 spondin, (च spondin) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E - 06 | .८३,६१,८१,२४८ | 0.००,१३,८०,१४१ | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | .१८०३१७९०४ | 1.35961E-05 | 0.६४,७३,३४,०५२ | 4.12268E - 09 | ||
| 1 MARCKS की तरह | AV110584 | 1437226_x_at | ०.१८६२३५९३५ | 1.47067E - 06 | 0.४९,९२,९१,३८७ | 2.34984E - 08 | ||
| 2 matrilin | BB338441 | 1455978_a_at | .१८७७८३५२८ | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0.२८२३३७८५३ | ||
| 2 matrilin | BC005429 | 1419442_at | ०.१८,८१,९५,७९५ | ०.०००१०५२९५ | .९१५५२८८९२ | 0.35282097 | ||
| 1 spondin, (च spondin) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन | BQ175871 | 1442613_at | ०.१८९९५६५६३ | 9.41195E - 06 | .८६१०३३२२२ | 0.1394266 | ||
| 3 arrestin, रेटिनल | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3.944218329 | 1.07437E-07 | ||
| आरआईकेईएन सीडीएनए जीन A330050F15 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0.००,०१,१९,३४२ | 0.६६०२८२०३५ | 2.47342E-05 | ||
| 3 contactin | BB559510 | 1438628_x_at | .१९४४०४६०८ | 4.08641E-07 | 0.९१,८७,४२,५९१ | 0.०२,२५,४५,२९७ | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | ०.१९६३८१३२१ | 2.24182E-05 | ०.६१,९३,०५,१२४ | 3.6222E-06 | ||
| गैस्ट्रीन पेप्टाइड रिहा | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2.752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin संबंधित VPS10 3 रिसेप्टर युक्त डोमेन | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | ०.०२९७३३६४९ | ||
| dopamine रिसेप्टर D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1.815881979 | 0.०००५१६४९८ | ||
| proprotein convertase / subtilisin Kexin 5 प्रकार | BB241731 | 1437339_s_at | 0.२१,०५,२८,०२७ | 7.83039E-05 | ०.५७,४१,२६,०७८ | 9.15496E-05 | ||
| इंटरल्यूकिन 1 रिसेप्टर, मैं लिखें | NM_008362 | 1448950_at | .२१,०५,७२,२४३ | 9.64524E - 06 | .२४११३५३५२ | 2.79816E - 08 | ||
Disclosures
पशु प्रयोगों देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं का प्रयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के नेशनल इंस्टीट्यूट के अनुसार में प्रदर्शन किया गया, और जानवरों की देखभाल और Fujita स्वास्थ्य विश्वविद्यालय में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित है.
Acknowledgments
हम क्योटो विश्वविद्यालय में विच्छेदन और उसे फिल्म के लिए समर्थन के लिए तकनीक Fujita स्वास्थ्य विश्वविद्यालय में सुश्री अकी Miyakawa पर उसके अनुदेश के लिए डॉ. योको Nabeshima धन्यवाद. जापान में MEXT से दर - इस काम बायोमेडिकल अभिनव क्षेत्रों एकीकृत ब्रेन रिसर्च (Shien) की प्राथमिकता पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता के राष्ट्रीय संस्थान स्वास्थ्य विज्ञान में मौलिक अध्ययन के संवर्धन के लिए प्रोग्राम के द्वारा समर्थित किया गया एक अनुदान सहायता में जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी के शिखा से.
References
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