Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Summary

Dal momento che James Thomson et al sviluppato una tecnica nel 1998 per isolare e far crescere hES in coltura, le cellule per un uso successivo congelamento e scongelamento ed espandere cellule da uno stock congelati sono diventati importanti procedure di routine effettuato in colture cellulari hES. Dato che le cellule hES sono molto sensibili alle sollecitazioni di gelo e disgelo, particolare cura deve intraprendere. Qui mostriamo la tecnica adeguata per il rapido scongelamento cellule hES provenienti dalle scorte di azoto liquido, placcatura loro sulle cellule embrionali di topo alimentatore, e lentamente li congelamento per la conservazione a lungo termine.

Abstract

Dal momento che James Thomson

Protocol

1. Scongelamento hES cellule

Pre-set-up sperimentale

1. Un giorno prima di scongelare le cellule hES, piatto uno strato alimentatore di fibroblasti di topo irradiati embrionali (MEF), CF1 sforzo, da un pozzetto di una gelatina rivestite 6 e piastra di coltura tissutale nel terreno di coltura MEF (D-MEM medio basale integrato con 10% di siero FBS e 1% di aminoacidi non essenziali). Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Prima di rimuovere le cellule hES da azoto liquido, essere sicuri di avere tutte le attrezzature necessarie e reagenti a posto e pronti da utilizzare per garantire un disgelo efficiente e di successo.

Scongelamento delle Cellule hES

3. Rimuovere una fiala criogenico di cellule hES dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido con pinze di metallo.
4. Stendere la fiala tra le mani guantate per 3-5 secondi per rimuovere il gelo.
5. Registrare le informazioni sull'etichetta del flaconcino.
6. Utilizzando pinze di metallo, immergere il flacone in un bagno d'acqua a 37 ° C. Ruotare delicatamente il flaconcino e osservare i progressi del disgelo spesso (ma velocemente!) Tenendo il flacone fino alla luce per vedere le dimensioni del cristallo di ghiaccio. Non immergere il tappo del flacone nel bagno d'acqua in quanto ciò potrebbe contaminare le cellule.
7. Quando solo un cristallo di ghiaccio rimane piccolo, immergere la fiala intera in etanolo per sterilizzare.
8. In un armadio di sicurezza biologica sterile, trasferire il contenuto della fiala criogenico direttamente al fondo di un tubo da 15 ml.
9. Lentamente aggiungere 4 ml di terreno di coltura cellulare hES (D-MEM/F-12 medio basale completato con la sostituzione Knockout 20% siero, 1% di aminoacidi non essenziali, 1% di L-glutammina, 0,2% β-mercaptoetanolo e 4 ng / ml bFGF) al tubo. Scuotere delicatamente per mescolare continuamente le cellule come il nuovo mezzo si aggiunge al tubo.
10. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 x g.

Placcatura Celle hES

11. Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, preparare il piatto alimentatore MEF, mediante l'etichettatura con l'apposito info cella hES: linea cellulare, il numero di passaggio, e la data disgelo.
12. Quando vi è di circa 2 minuti dalla fine del periodo di rotazione, aspirare il terreno di coltura MEF e aggiungere 1,0 ml di PBS al pozzo.
13. Portare le cellule pellet hES torna alla cappa di sicurezza biologica, e con attenzione aspirare il surnatante. Fare attenzione a non aspirare il pellet, ma rimuovere il più surnatante possibile, in quanto questa soluzione contiene DMSO dal mezzo di congelamento.
14. Risospendere il pellet molto delicatamente con l'aggiunta di 2,5 ml di terreno di coltura cellulare hES utilizzando una pipetta di vetro 5 ml e pipettare 3-4 volte.
15. Aspirare il PBS dall'alimentatore MEF bene e aggiungere lentamente tutti i 2,5 ml di sospensione cellulare hES al preparato bene del 6 pozzetti.
16. Collocare la piastra nel 37 ° C incubatore e con attenzione scorrere la piastra in avanti a indietro, e un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule in tutto il bene. Non agitare il piatto in un modello circolare per evitare di concentrare le colonie al centro.
17. Permettono alle cellule di fissare a 37 ° C e 5% CO ₂ durante la notte.
18. Il giorno dopo il disgelo, rimuovere il supporto (con eventuali cellule galleggiante) e aggiungere 2,5 ml di fresca terreno di coltura cellulare hES al pozzo.
19. Opzionale: Il mezzo rimosso e le cellule possono essere trasferiti su un piatto preparato alimentatore separato MEF. Questa operazione genera spesso nuove colonie che può essere coltivato in parallelo con le cellule dal disgelo originale.
20. Incubare le piastre a 37 ° C di CO ₂ e il 5% durante la notte.

2. Congelamento delle Cellule hES

1. Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, etichetta le fiale criogenica all'interno della cappa di sicurezza biologica, inclusa la linea cellulare, il numero di passaggio, e la data di congelamento. La densità tipica per il congelamento delle cellule hES è un pozzo di cellule (da una a 6 pozzetti) per flaconcino criogenico.
2. Quando le cellule sono finiti hES centrifugazione, portare i tubi dietro alla cappa di sicurezza biologica. Aspirare il surnatante dal tubo, facendo attenzione a non disturbare il vagamente ricco di pellet.
3. Risospendere il pellet cellulare con la giusta quantità di terreno di coltura cellulare hES: 0,5 ml di cellule hES terreno di coltura per flaconcino criogenico. Siate molto gentile durante il pipettaggio, come le cellule hES recuperare meglio se congelati in pezzi colonia relativamente grandi.
4. Lentamente, mentre scuotendo leggermente il tubo, aggiungere la giusta quantità (0,5 ml per provetta Microbank ™) di media 2X congelamento delle cellule hES (60% FBS definito, il 20% delle cellule hES terreno di coltura, e il 20% DMSO) per le cellule. Una volta che il medium di congelamento è aggiunto, pipetta la soluzione estrema dolcezza 1-2 volte per mescolare.
5. Rapidamente, ma delicatamente, aggiungere 1 ml di sospensione cellulare per ogni flacone criogenici.
6. Trasferire le provette in un contenitore congelamento isopropanolo e posto inuno congelatore -80 ° C durante la notte. Le cellule si blocca a 1 ° C al minuto nel contenitore congelamento isopropanolo.
7. Il giorno seguente, trasferire rapidamente le fiale congelato in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido con pinze di metallo.

Rappresentante Risultati

Il primo giorno dopo cellule staminali embrionali umane sono scongelati, piccole colonie possono apparire trasparente e può essere difficile da vedere sotto il microscopio. Dato che le cellule ES appena scongelati lentamente tendono a proliferare, possono richiedere qualche giorno di apparire come stabilito colonie (Figura 1).

Figura 1. Il recupero e la crescita cellulare. Cellule hES scongelato da azoto liquido sono stati imaged Giorni 1, 7 e 11 dopo lo scongelamento.

Discussion

Il video che accompagna illustra un metodo per lo scongelamento e congelamento delle cellule HES. Cellule congelate in azoto liquido deve essere scongelato bagno il più rapidamente possibile per ottenere il miglior recupero possibile. Ricordatevi di essere estremamente attenti quando pipettaggio cellule scongelamento: ridurre al minimo la manipolazione delle cellule e pipettare delicatamente. Un flaconcino di cellule hES può essere placcato su uno dei due e di un 6-pozzetti, o tutti i pozzetti di un 4-pozzetti e subito messo in incubatrice. Dal momento che la coltura in quattro pozzetti separati riduce la possibilità di perdere tutta la cultura alla contaminazione, e rende più facile individuare le colonie di cellule hES sulla superficie più piccola, il 4-pozzetti è consigliato quando scongelamento cellule hES per la prima volta.

Il primo giorno dopo lo scongelamento cellule hES, le colonie sono piccole e possono essere trasparenti. Riempire la media delle cellule hES cultura ogni giorno, anche se le colonie non sono evidenti sotto il microscopio in quanto può richiedere qualche giorno in coltura per cellule hES di apparire come colonie stabilite. E 'importante utilizzare un fresco strato placcato alimentatore MEF quando lo scongelamento le cellule, come le colonie spesso non raggiungono una dimensione appropriata per passaging fino a 10 12 giorni dopo il disgelo.

Quando lo scongelamento una fiala basso passaggio di cellule hES, è buona per espandere e congelare fiale aggiuntive per mantenere uno stock di cellule passaggio basso per la cultura e gli esperimenti futuri. E 'anche una buona idea di congelare regolarmente tutte le "extra" le cellule sane hES per mantenere scorte congelate. Il disgelo di maggior successo e le culture successive sono stati congelati in alta qualità, indifferenziato, attivamente dividendo colonie di cellule HES. cellule hES recuperare da un blocco in modo più efficiente se maneggiato con delicatezza come aggregati di cellule più grandi. La dimensione aggregata finale dovrebbe essere simile a quello (o leggermente più grande) le dimensioni degli aggregati placcato dopo un passaggio di routine.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM	Invitrogen	11965-092	For MEF mediumjavascript:void(0);
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified	Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12	Invitrogen	11330-057
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF	Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11140-050
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS	Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	Type A, Porcine
DMSO	Sigma-Aldrich	D2560	For freezing medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined	Hyclone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates	Nalge Nunc international	140675	For general culture
4-well plates	Nalge Nunc international	176740	For thawing
5 mL glass pipettes	Fisher Scientific	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes	Corning	430052	Polypropylene
Cryogenic vials	Nalge Nunc international	5000-1020	1.5 mL capacity
Freezing container	Nalge Nunc international	5100-0001	Mr. Frosty”