Summary
Так как Джеймс Томсон и др. разработали методику в 1998 году, чтобы изолировать и выращивать ЭСК в культуре, замораживание клеток для последующего использования и оттаивания и расширения клетки из замороженного фондовом стали важными процедур, выполняемых в повседневной культуре клеток ЭСК. С ЭСК клетки очень чувствительны к стрессам, замораживания и оттаивания, особое внимание необходимо предпринять. Здесь мы показываем, правильную технику для быстрого таяния ЭСК клетки из ликвидных акций азота, покрытие их на мышиных эмбриональных клетках подачи, и медленно замораживания их для длительного хранения.
Abstract
Так как Джеймс Томсон
Protocol
1. Размораживание ЭСК клетки
Предварительно экспериментальной установки
- За день до оттаивания ЭСК клетки, плиты фидерного слоя облученного мышиных эмбриональных фибробластов (ОМ), CF1 штамм, на одной скважине желатин покрытием 6-и культуре ткани пластины в культуральной среде MEF (D-MEM базальной среде, дополненной 10% тепла инактивированной FBS и 1% без незаменимых аминокислот). Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2.
- Перед удалением ЭСК клетки от жидкого азота, убедитесь, что имеют все необходимое оборудование и реактивы на месте и готов к использованию для обеспечения эффективной и успешной оттепель.
Размораживание ЭСК клетки
- Удалить криогенных флакон клеток ЭСК из жидкого азота резервуара с использованием металлических щипцов.
- Ролл флакон между руками в перчатках в течение 3-5 секунд, чтобы удалить мороза.
- Запись информации на этикетке флакона.
- Использование металла пинцетом, погружают флакона в 37 ° С водяной бане. Swirl флакон нежно и наблюдать за ходом оттепели часто (но быстро!), Держа флакон на свет, чтобы увидеть размер кристаллов льда. Не погружайте крышку флакона в ванну с водой, поскольку это может попасть в клетки.
- Когда только небольшой кристалл льда остается, погрузить весь флакон в этаноле для стерилизации.
- В стерильном кабинете биологической безопасности, передача содержимого флакона криогенных непосредственно к нижней части 15 мл коническую трубку.
- Медленно добавьте 4 мл ГЭК культуральной среде клетки (D-MEM/F-12 базальной среде, дополненной 20% Нокаут сыворотке замены, 1% без незаменимых аминокислот, 1% L-глутамина, 0,2% β-меркаптоэтанол и 4 нг / bFGF мл) к трубе. Осторожно постоянно смешивать клетки новое средство добавляется в трубке.
- Центрифуга клетки в течение 5 минут при 200 х г.
Покрытие ЭСК клетки
- Хотя ЭСК клетки находятся в центрифугу, подготовить пластину MEF подачи путем маркировки с соответствующей ячейке ЭСК информация: клеточная линия, проход номер и дата оттепели.
- Когда есть примерно через 2 минуты вышел на спину время аспирации среды MEF культуры и добавить 1,0 мл ФСБ к колодцу.
- Принесите гранулированный клетках ЭСК обратно в кабинет биологической безопасности, а также тщательно аспирата супернатант. Будьте осторожны, чтобы не аспирата осадок клеток, но и удалить как можно больше супернатант насколько это возможно, так как это решение содержит ДМСО от замерзания среды.
- Повторное приостановить гранул очень осторожно, добавляя 2,5 мл ГЭК культуральной среде ячейку с помощью 5 мл пипетки и стеклянные пипетки 3-4 раза.
- Аспирируйте PBS от подачи MEF хорошо и постепенно добавить все 2,5 мл клеточной суспензии ЭСК на подготовленную лунку 6-луночный планшет.
- Место пластинки в 37 ° C инкубатора и аккуратно вставьте пластину вперед-назад, и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки во всем хорошо. Не вращать пластинки в круговой схеме, чтобы избежать концентрации колоний в центре.
- Разрешить клетки приложить при 37 ° С и 5% CO 2 за одну ночь.
- На следующий день после оттепели, удалите среды (с любым плавающие клетки) и добавить 2,5 мл свежей среды, культуры клеток ЭСК к колодцу.
- Дополнительно: удален средних и клетки могут быть переданы отдельные подготовленный фундамент подачи MEF. Этот шаг часто порождает новые колонии, которые могут быть культурным параллельно с ячейками от первоначального оттепель.
- Инкубируйте пластин при 37 ° С и 5% CO 2 за одну ночь.
2. Замораживание ЭСК клетки
- Хотя ЭСК клетки находятся в центрифуге, этикетка криогенных флаконах внутри биологических кабинета безопасности, включая клеточную линию, проезд номер и дату замораживания. Типичные плотности для замораживания клетки ЭСК является одним хорошо клеток (от 6-луночный планшет) на криогенном флаконе.
- Когда ЭСК клетки закончил центрифугирования, довести трубы обратно в кабинет биологической безопасности. Аспирируйте супернатант из трубки, стараясь не мешать свободно упаковке осадок клеток.
- Ресуспендируют осадок клеток с соответствующим количеством ЭСК клеточных культур среды: 0,5 мл клеточной культуре ЭСК среды на криогенном флаконе. Будьте очень внимательны при пипетки, а ЭСК клетки восстановить лучше, когда замороженные в относительно больших частей колонии.
- Медленно, в то время как осторожно встряхивая трубу, добавить соответствующую сумму (0,5 мл на криопробирку) из 2х ЭСК ячейки замерзания среды (60% определены FBS, 20% ГЭК культуре клеток средних и 20% ДМСО) в клетки. После замерзания среды добавил, пипетки решение крайне осторожно один-два раза перемешать.
- Быстро, но осторожно, добавляют 1 мл клеточной суспензии для каждого криогенного флаконе.
- Передача флаконов в изопропанол контейнер замораживания и место в-80 ° C морозильник на ночь. Клетки заморозить на 1 ° C в минуту в изопропанол контейнер замораживания.
- На следующий день, быстро передавать замороженных флаконов с жидкостью резервуар азота с использованием металлических щипцов.
Представитель Результаты
Первый день после человеческие клетки ES размораживают, небольшие колонии могут появиться прозрачные и может быть трудно увидеть под микроскопом. С новым талой ЭС клетки, как правило, распространяются медленно, они могут занять несколько дней, чтобы выглядеть как основали колонии (рис. 1).
Рисунок 1. Восстановление и рост клеток. ЭСК клетки талой от жидкого азота были обследованы 1, 7 и 11 дней после оттаивания.
Discussion
Сопровождающее видео демонстрирует метод для оттаивания и замораживания ЭСК клетки. Клетки замораживают в жидком азоте должно быть талой ванны как можно быстрее получить наилучшее восстановление. Помните, чтобы быть очень осторожны, когда пипетирования оттаивания клетки: минимизировать обработку клеток и пипеткой осторожно. Один флакон клеток ЭСК могут быть покрыты либо на одну лунку 6-луночный планшет, или все скважины 4-луночного планшета и сразу же помещают в инкубатор. После культивирования в четырех отдельных скважин снижает возможность потери всей культуре к загрязнению, и делает его легче найти ЭСК клеточных колоний на меньшей площади, 4-луночного планшета рекомендуется при оттаивании ЭСК клетки в первый раз.
Первый день после оттаивания ЭСК клетки колонии малого и может быть прозрачным. Пополнение культуры ЭСК клеточной среде каждый день, даже если колониях не очевидны под микроскопом, поскольку он может занять несколько дней в культуре клетки ЭСК выступать в качестве основали колонии. Важно использовать только что покрытая слоем MEF подачи при оттаивании клеток, а колонии часто не доходят до соответствующего размера для пассажей до 10 12 дней после оттепели.
При оттаивании низкий флакон прохождения клетками ГЭС, это хорошая практика для расширения и заморозить дополнительные флаконы для поддержания запаса низкой клетки проход для будущей культуры и экспериментов. Это также хорошая идея, чтобы регулярно заморозить все "лишние" здоровые клетки ЭСК поддерживать замороженные запасы. Наиболее успешным оттепелей и последующих культур были заморожены как высококачественные, недифференцированной, активно делящихся колонии ЭСК клетки. ЭСК клетки оправиться от замораживания более эффективно, если обращаться нежно, как более крупные агрегаты клеток. Окончательный размер совокупного должны быть похожи на (или чуть больше) размер агрегатов покрытием после рутинной проход.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
