Aorta Ring Assay

Summary

Angiogenese, is het kiemen van de bloedvaten van de reeds bestaande vaatstelsel, verbonden aan zowel natuurlijke en pathologische processen. Hier laten we zien een aorta-ring-test die het mogelijk maakt angiogene potentiators en remmers direct worden toegevoegd aan aorta-ringen in cultuur. Kieming en uitgroei neovessel kan worden bepaald door het inspecteren van de aorta-ringen over een periode van 6-12 dagen.

Abstract

Angiogenese, is het kiemen van de bloedvaten van de reeds bestaande bloedvaten geassocieerd met zowel natuurlijke en pathologische processen. Verschillende angiogenese assays betrekking hebben op de studie van individuele endotheelcellen in kweekomstandigheden (1). De aorta-ring test is een angiogenese model dat is gebaseerd op de orgelcultuur. In deze test, angiogene schepen groeien van een deel van de aorta (gewijzigd van (2)). In het kort, de muis thoracale aorta is uitgesneden, zijn de vetlaag en de adventitia verwijderd, en ringen van ongeveer 1 mm lang worden voorbereid. Individuele ringen zijn vervolgens ingebed in een kleine vaste koepel van kelder matrix extract (BME), cast binnen afzonderlijke wells van een 48-well plaat. Angiogene factoren en remmers van angiogenese kan direct worden toegevoegd aan de ringen, en een gemengde co-cultuur van aorta-ringen en andere celtypes gebruik kunnen worden gebruikt voor de studie van de paracriene angiogene effecten. Kiemen wordt waargenomen door de inspectie onder een stereomicroscoop over een periode van 6-12 dagen. Vanwege de grote variatie wordt veroorzaakt door de onregelmatigheden in de aorta segmenten, experimenten in de 6-plicates is sterk aangeraden. Neovessel uitgroei wordt bewaakt het hele experiment en beeld gebracht met behulp van fase microscopie, en de supernatanten worden verzameld voor het meten van de relevante angiogene en anti-angiogene factoren, celdood markers en nitriet.

Protocol

Een dag voor het experiment:

1. Laat BME (verminderde groei factor, Cultrex, Trevigen) te ontdooien op ijs of bij 4 ° C, eenmaal ontdooid te houden op het ijs opnieuw te stollen te voorkomen.

Dag van het experiment:

1. Muizen (6-7 weken oud) worden verdoofd en bloedde uit.
2. Verwijder de thoracale aorta in een petrischaal gevuld met koude steriele PBS.
3. Voer de mechanische reiniging van de omliggende vetweefsel. Let op, voorkomen dat ze uitdrogen van de aorta op elk moment.
4. Met behulp van een chirurgisch mes, slice Aorta gelijkmatig in een mm ringen. De snede moet uniform zijn en schoon zijn.
5. Overdracht ringen verse koude PBS en blijf op het ijs te allen tijde.
6. Met behulp van pre-gekoelde pipetpunten, toe te voegen aan elk putje in een 48-well plaat een afgeronde daling van 150 ml koud BME. Laat de BME druppel te stollen bij 37 ° C gedurende 20-30 minuten.
7. Plaats een aorta-ring in de top midden van elke koepel. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
8. Op de top van elke ring een extra 150 ml BME. Incubeer gedurende 20-30 minuten bij 37 ° C.
9. Bereid medium: Human endotheliale serum vrij medium (GIBCO, Carlsbad, CA), aangevuld met 2% FCS, 50 eenheden / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine (Cellgro).
10. Aan elk putje toe te voegen 500 ml medium dat ofwel:
    1. Experimentele monsters.
    2. Positieve controle: Endotheliale celgroei supplement (ECG's, uiteindelijke concentratie 200 ug / ml, BD Biosciences).
    3. Negatieve controle: Medium alleen.
11. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 12 dagen, foto ringen tussen dag 6 en 12 onder standaard fase-contrast stereoscoop.
12. Optioneel: Verzamel supematanten.

Opmerkingen:

1. Houden steriele omstandigheden te allen tijde.
2. Voorkomen dat de invoering van bubbels in de BME.

Discussion

Aorta-ring-test is een gunstig hulpmiddel op de weg te evalueren angiogene en anti-angiogene factoren. De schepen die uit groeien van aorta-ringen werven gladde spiercellen en pericyten te associëren met de endotheelcellen buis, wat betekent dat ze anatomisch vergelijkbaar met neovessels in vivo. Bovendien is de muis aorta-ring test houdt het voordeel van de enorme serie van transgene tools beschikbaar voor deze soort. Toch zijn er verschillende nadelen aan de aorta-ring test. Eerste schepen uitgroei in vivo plaatsvindt van haarvaten en niet van grote bloedvaten zoals de aorta. Ten tweede, inconsistentie in de behandeling van de ringen en de hoeveelheid van de omgevende weefsels nog op het schip kunnen beïnvloeden schip uitgroei. Ringen van verschillende aorta of verschillende muizen leeftijden en stammen kunnen ook interfereren met de angiogene respons. En tot slot, Angiogene schip uitgroei komt voor in drie dimensies, waardoor het niet ideaal om te fotograferen en te kwantificeren. Tezamen genomen, wanneer deze wordt uitgevoerd met voldoende interne controles en met meerdere herhalingen, deze test is relatief eenvoudig, niet-dure, zeer informatieve en significant beter dan endotheliale culturen in de biologische complexiteit en relevantie.