Summary
ووصف المنهجية لعزل الوزن الجزيئي عالية وعالية الجودة من الحمض النووي الجينومي المجتمع الميكروبي في التربة.
Abstract
وmicrobiome التربة هي الخزان واسعة وغير مستكشفة نسبيا من التنوع الجيني والابتكار الأيضية التي ترتبط ارتباطا وثيقا مع تدفق المواد الغذائية والطاقة داخل النظم الإيكولوجية الأرضية. زراعة مستقلة الجينومية البيئية ، والمعروف أيضا باسم metagenomic ، ونهج الوصول الوعد لم يسبق له مثيل على هذه المعلومات الوراثية في مجال التعمير والمسار الوظيفي للفحص العلاجية ذات القيمة العالية وعمليات تحويل الكتلة الحيوية. ومع ذلك ، فإن التربة microbiome لا يزال يمثل تحديا إلى حد كبير بسبب صعوبة الحصول على الحمض النووي الوزن الجزيئي عالية من الجودة واسعة تكفي لادخال الانتاج المكتبة. هنا نقدم مشروع بروتوكول لاستخراج الوزن الجزيئي عالية ، والحمض النووي الجينومي الميكروبي المجتمع من التربة والرواسب. نوعية الحمض النووي الجيني معزولة مثالية لإدراج بناء مكتبات بيئية كبيرة للتطبيقات تسلسل الجينوم والفرز المصب.
الإجراء يبدأ تحلل الخلية. وlysed جدران الخلايا والأغشية الميكروبات من قبل كل القوى الميكانيكية (طحن) والكيماوية (β - المركابتويثانول). ثم يتم عزل الحمض النووي الجينومي العازلة باستخدام الاستخراج ، والكحول والكلوروفورم ، isoamyl ايزوبروبيل. المخازن المؤقتة المستخدمة للتحلل والخطوات تشمل استخراج ثيوسيانات الجوانيدين وبروميد hexadecyltrimethylammonium (CTAB) للحفاظ على سلامة عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجيني. اعتمادا على التطبيق الخاص المصب ، يمكن عزل الحمض النووي الجيني النقي باستخدام مزيد من كلوريد السيزيوم (CSCL) تنبيذ فائق التدرج ، مما يقلل من الشوائب بما في ذلك الأحماض الدبالية. الإجراء الأول والاستخراج ، ويأخذ 8 ساعات تقريبا ، باستثناء الخطوة الكمي الحمض النووي. تنبيذ فائق التدرج في CSCL ، هو عملية يومين. أثناء العملية كلها ، يجب أن تعامل برفق الحمض النووي الجيني لمنع القص ، وتجنب vortexing شديدة ، وقاسية pipetting المتكررة.
Protocol
الجزء الأول : استخراج الحمض النووي
إجراء
1. ويلزم 8 ساعات ، لتجهيز 6 عينات من الحمض النووي باستثناء الكمي.
قبل البدء في استخراج ، وسوف تحتاج إلى ما قبل البرد مدقة وهاون والبسط في الفريزر -20 درجة مئوية أو باستخدام النيتروجين السائل. أيضا ، قبل البرد التي تحتوي على 50 مل من أنابيب 20 مل كلوروفورم كحول أيزو أميلي (24:1) على الجليد. تعيين فرن التهجين إلى 65 درجة مئوية لتسخين المسبق. الاختيار حل CTAB ، إذا تبلور دافئة إلى 60 درجة مئوية لإذابة البلورات. الحل الشامل وتغيير طبيعة العازلة الاستخراج عن طريق إضافة مكونات الماضي فقط قبل بدء الاستخراج (انظر الوصفة أدناه). إجراء كافة الإجراءات الاستخراج في غطاء الدخان.
2. إعداد العازلة تغيير طبيعة والعازلة الاستخراج.
ملاحظة : لتعظيم العائد الحمض النووي ، فمن الأهمية بمكان على وجه التحديد لجعل مخازن اتباع التعليمات.
3. مكان 2 غرام من التربة في بمدافع الهاون قبل مبردة.
ملاحظة : يجب تجميد التربة التي تم جمعها في الميدان على الجليد الجاف لنقل وتخزين في -80 درجة مئوية. ذوبان الجليد والتربة باستخدام منخل منخل 2 مم قبل استخراج الحمض النووي. يمكنك زيادة كمية بدءا من التربة تصل إلى 10 غرام.
4. إضافة 1 مل من حل لتغيير طبيعة التربة.
5. تجميد وطحن التربة في N 2 السائل باستخدام مدقة حتى جزيئات التربة المسحوقة وتبدو متجانسة. تكرار تجميد وطحن مرتين.
ملاحظة : حافظ على عينة التربة المتجمدة خلال طحن ، وذلك باستخدام النيتروجين السائل ما يكفي لتغطية كامل عينة التربة. ذوبان طفيفة خلال طحن غير مقبولة.
6. نقل التربة الأرض لأنبوب مخروطي 50 مل باستخدام ملعقة قبل مبردة.
ملاحظة : يمكن تخزين عينة التربة في الأرض -80 درجة مئوية في هذه النقطة ، إذا لزم الأمر.
7. إضافة 9 مل من العازلة الاستخراج. الحل لخلط والتربة ، لفترة وجيزة في دوامة السرعة المنخفضة.
ملاحظة : لضمان العازلة متجانسة ، انها دافئة في 60 لمدة 10-15 دقيقة قبل الاستعمال درجة مئوية. تحتفظ بما تبقى من العازلة عند 60 درجة مئوية في جميع أنحاء الاستخراج. الدوامة بسرعة 8 (على نطاق وحيث يمثل الرقم 10 كحد أقصى).
8. احتضان لمدة 40 دقيقة عند درجة 65 في فرن التهجين. أثناء الحضانة ، وتناوب مستمر الأنابيب بأقل سرعة ، أو عكس بلطف الأنابيب كل 10 دقيقة.
ملاحظة : ضع الأنبوب أفقيا في فرن التهجين العازلة للسماح للاتصال التربة على مساحة كبيرة. الحل قد تبدو لزجة قليلا أثناء الحضانة.
9. ز س الطرد المركزي في 1800 ، لمدة 10 دقيقة في 10-14 درجة مئوية. نقل طاف في الأنبوب قبل المبردة مخروطية 50 مل تحتوي على 20 مل كلوروفورم كحول أيزو أميلي (24:1) ، والحفاظ على الجليد.
ملاحظة : عند نقل طاف ، يجب الحرص على عدم تعكير صفو الطبقة العضوية (الطبقة السفلى). ترك 1-2 مل من طاف إذا كان ذلك ضروريا من أجل جمع طاف النظيف فقط. يمكنك كثيرا ما نرى طبقة البيج (1-3 ملم تقريبا في سمك) على رأس طاف. لا تخل هذه الطبقة عندما جمع طاف. محاولة لتمرير معلومات سرية على طول الجدار أنبوب لمنع الكسر من هذه الطبقة البيج. إذا عكر جدا وطاف ، كرر استخراج الكحول كلوروفورم isoamyl مرة أخرى على طاف. لا تستخدم الماصات البلاستيكية عند نقل كلوروفورم ، والكلوروفورم وإذابة البلاستيك. استخدام ماصة الزجاج ، الزجاج أو تخرج اسطوانة ، أو كلوروفورم تصب مباشرة في أنابيب مخروطية 50 مل.
10. استخراج حبيبات التربة 2 أكثر الأوقات ؛
10.1. إضافة 5 مل استخراج العازلة للكريات التربة ، وبلطف باستخدام مزيج 1 مل غيض تليها vortexing قصيرة في سرعة منخفضة.
ملاحظة : اهتز ومزج العازلة قبل الاستخدام.
10.2. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في الفرن التهجين. ز س الطرد المركزي في 1800 ، لمدة 10 دقيقة في 10-14 درجة مئوية.
طاف لنقل أنبوب في الخطوة 9. مع الحفاظ على أنبوب جمع طاف والكحول كلوروفورم isoamyl على الجليد خلال الاستخراج.
ملاحظة : تأكد من إضافة طاف على نفسها من دون أنبوب عبر الخلط بين العينات.
10.3. كرر 9.1 و 9.2 مرة أخرى.
11. استخدام لوحة الدورية جدا صخرة بلطف الأنبوب الذي يحتوي على طاف جمعها (14-19 مل) ، وكلوروفورم كحول أيزو أميلي على 1.25 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة : إغلاق الغطاء بإحكام شديد لمنع التسرب. وضع منشفة ورقية على لوحة هزاز قبل وضع الأنبوب بحيث يمكن الكشف عن أي تسرب بسهولة.
12. ز س الطرد المركزي في 1800 ، لمدة 20 دقيقة في 10-14 درجة مئوية.
13. نقل إلى المرحلة المائية أنبوب جديد.
ملاحظة : لا تخل الطور البيني بين المرحلة المائية (الطبقة العليا) وطبقة العضوية (القاعطبقة) عند نقل طاف. ترك حوالي 1،5-2 مل طاف لضمان جمع طاف النظيف فقط.
14. استرداد باستخدام الحمض النووي ايزوبروبيل (الخطوة 15.a -- 21.a). بدلا من ذلك ، استخدم Amicon ® الترا - 15 أجهزة الطرد المركزي فلتر (الخطوة 15.b -- 21.b) إذا كنت تتوقع كمية قليلة جدا من الكتلة الحيوية في عينتك ، والتي سوف تنتج بالكاد مرئية بيليه عن طريق الترسيب ايزوبروبيل يصعب الشفاء.
15.a. مكان طاف نابذة فائقة السرعة إلى أنبوب جديد.
16.a. إضافة إلى ايزوبروبيل طاف جمعها في نسبة حجم 0.6:1. عكس أنابيب بلطف عدة مرات لالمزيج.
17.a احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
18.a. ز س الطرد المركزي في 16000 ، لمدة 20 دقيقة في 20 -- 25 م. ضمان التوازن في أوزان الأنابيب جيدا قبل كل خطوة الطرد المركزي.
ملاحظة : مارك اتجاه قوة الطرد المركزي في أنبوب ، وحتى تتمكن من الكشف عن الحمض النووي بيليه بسهولة أكبر عندما يكون المحصول الحمض النووي منخفضة.
19.a. إزالة ايزوبروبيل بواسطة الصب أو شفط فراغ. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الحمض النووي.
ملاحظة : إزالة ايزوبروبيل بمجرد اكتمال الطرد المركزي. نكون حذرين للغاية لعدم فقدان بيليه الحمض النووي. يمكن أن حجم الكريات الحمض النووي على نطاق واسع يختلف تبعا لنوع التربة واضحة للعيان من (~ مم 9) إلى بالكاد مرئيا. فمن المستحسن لإزالة بقايا الكحول الآيزوبروبيل بواسطة المص على طول جدار الأنبوب بعناية حتى لا لشفط خارج بيليه الحمض النووي.
20.a. بيليه الجافة الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 -- 20 دقيقة.
ملاحظة : لا أكثر من بيليه DNA الجافة ، وإلا فإنه سيكون من الصعب redissolve الحمض النووي.
21.a. Resuspend بيليه في الحمض النووي في 200 TE ميكرولتر. انها مزيج من خلال استغلال لطيف. الحل نقل الحمض النووي في أنبوب مل 1.5. الحفاظ على أنبوب في 4 درجات مئوية خلال الليل من أجل حل كامل الحمض الريبي النووي.
ملاحظة : اعتمادا على حجم بيليه ، يمكنك ضبط حجم TE إضافته. عادة 200 -- 400 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات تعمل بشكل جيد.
* وبدلا من اتباع الخطوات 15.b -- 21.b.
15.b. قبل غسل an Amicon ® الترا - 15 أجهزة الطرد المركزي تصفية ؛ إضافة 15 مل TE إلى جهاز الطرد المركزي في وز س 3500 ، لمدة 10 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
16.b. وضع حل الحمض النووي من 13 خطوة لتصفية Amicon قبل غسلها. ز س الطرد المركزي في 3500 حتى يتم تقليل حجم الحمض النووي ل200-500 ميكرولتر. تجاهل التدفق من خلال.
17.b. غسل الحمض النووي مع TE مرتين ، إضافة إلى 10 مل TE الأجهزة تصفية Amicon. ز س الطرد المركزي في 3500 حتى يتم تقليل حجم الحمض النووي لنحو 200 ميكرولتر. تجاهل التدفق من خلال. أكرر مرة أخرى.
18.b. الحل نقل الحمض النووي على فلتر لأنبوب جديد مل 1.5.
19.b. إضافة TE 40 ميكرولتر إلى تصفية Amicon. غسل جانبي الأغشية تصفية حسب pipetting صعودا وهبوطا من أجل استرداد أي بقايا الحمض النووي على التصفية. إضافة إلى هذا الحل يغسل الأنبوب في خطوة 18.b.
20.b. إذا لزم الأمر ، يمكن للمزيد من الحمض النووي التي تتركز ® Microcon YM - 30 وحدة تصفية Ultracel الطرد المركزي ، قبل لغسل تصفية بإضافة 200 TE ميكرولتر والطرد المركزي في ز س 10000 لمدة 7 دقائق. إضافة محلول الحمض النووي للتصفية وأجهزة الطرد المركزي في 5000 س ز ل 1 دقيقة. كرر الطرد المركزي حتى كمية الحمض النووي على حل تصفية خفضت إلى 50 ميكرولتر تقريبا.
ملاحظة : الحد الأقصى لحجم العينة الأولية لتصفية Microcon هو 500 ميكرولتر. لا أكثر من أجهزة الطرد المركزي بسرعات ز س 14000 لا أكثر من أجهزة الطرد المركزي حتى يجف الغشاء تماما. ضمان أن تغطي بعض السائل لا يزال المرشح بعد الطرد المركزي. إذا كنت على طرد والغشاء يجف ، ثم إضافة 15 TE ميكرولتر ، تستنهض الهمم برفق لمدة 30 ثانية ، وانتقل إلى الخطوة 21.b.
21.b. مكان وحدة تصفية رأسا على عقب في أنبوب Microcon جديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق لاستعادة الحمض النووي.
22. تحديد الحمض النووي عن طريق جل تاي (0.8 ٪ ، 0.5xTAE ، 50 V لمدة 4 ساعات) ، ومعمل أو Nanodrop بيكو الخضراء مقايسة والقارئ لوحة.
ملاحظة : يمكن تقدير كمية الحمض النووي بمقارنة عينة لفرقة الفرقة المعروفة مع التركيز علامة (علامة عالية الحمض النووي الجزيئية أو λHindIII) على هلام.
23. التحقق من سلامة عالية الوزن الجزيئي باستخدام الحمض النووي نابض الكهربائي جل الميدانية (PFGE) مع 1 ٪ ، 1xTAE الجل (لمزيد من التفاصيل ، انظر الخطوة الثانية ، في part2 http://www.jove.com/index/details.stp؟id = 1387 ، دوى : 10.3791/1387 بواسطة Taupp وآخرون 2009).
ملاحظة : يمكنك استخدام agarose هلام العادية لهذا الغرض بدلا من مراقبة الجودة agarose انصهار منخفضة. باختصار ، الشروط الكهربائي هي كالتالي : 2-250 كيلوبايت ، 6 فولت ، الأولي وقت التبديل : 5 ثانية ونهائية وقت التبديل : 15 ثانية ، لمدة 12 ساعة تشغيل في 14 درجة مئوية. SYBR الذهب تلطيخ لمدة ساعة واحدة لتصور ال DNA على الجل.
24. إذا كانت الأوزان الجزيئية من الحمض النووي المستخرج مرضية ، ثم الشروع في ما يلي CSCL التدرج خطوة الطرد المركزي. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية ، أو -80 درجة مئوية قبل الطرد المركزي CSCL.
يجب أن يكون حجم متوسط من الحمض النووي يمكن أن يساوي أو يتجاوز 36 كيلو بايت ، إذا كنت ترغب في بناء مكتبة كبيرة metagenomic ادخال الحمض الريبي النووي.
الجزء الثاني. تنقية الحمض النووي باستخدام تنبيذ فائق التدرج كلوريد السيزيوم
إعداد أجهزة الطرد المركزي : 1.5 -- 2 ساعة
خطوة الطرد المركزي : 18 ساعة
إزالة بروميد إيثيديوم (EtBr) والتركيز الحمض النووي بعد الطرد المركزي : 3 ساعات
إجراء
لمزيد من التفاصيل ، راجع رايت وآخرون. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp؟id=1352 ، دوى : 10.3791/1352
نتائج ممثل / نتائج
المبلغ الإجمالي من الحمض النووي الجينومي المعزولة من 2 غرام من الغابات العضوية في التربة (O الأفق) وآفاق المعدنية (AE ، AB ، وآفاق راثيا) (عينات من التربة الإنتاجية على المدى الطويل (LTSP) تقع في موقع البحيرة Skulow ، BC ، كندا وتراوحت تدار من قبل وزارة الغابات وق المدى) في الفترة من 10 ملغ إلى 180 ملغ. وكان متوسط حجم الحمض النووي معزولة عادة ما بين 40-60 كيلو بايت (الشكل 1). كانت نسبة الامتصاصية في 260 نانومتر nm/280 بين 1،3-1،6 وكان هناك الذروة عند 230 نانومتر ، والتي قد تشير إلى تلوث الدبالية حمض وحظ في كثير من الأحيان في عينات التربة. والطرد المركزي انخفاض شديد الانحدار CSCL هذا التلوث وزادت أيضا نسبة إلى 260/280 1،8-1،9 كما هو مبين في الشكل 2A و 2B.
الشكل 1. PFGE الصور من الحمض النووي المستخرج الجينومية قبل تنبيذ فائق CSCL. lane1 : 1 كيلوبايت علامة 100 نانوغرام ، 2 لين : λHind الثالث علامة 100 نانوغرام ، لين 3 : λHind الثالث علامة 250 نانوغرام ، لين 4 : λHind الثالث علامة 500 نانوغرام ، lane5 : Fosmid 36 كيلوبايت علامة 100 نانوغرام ، لين 6 و 7 : الجينومية الحمض النووي معزولا عن أفق عزت المعدنية في التربة ، لين 8 و 9 : الحمض النووي الجيني معزولا عن أفق AB المعدنية في التربة في موقع يقع LTSP Skulow البحيرة ، BC
الشكل 2. Chromograms من الحمض النووي الجيني قبل الكشف عنها من قبل معمل (أ) وبعد CSCL تنبيذ فائق (B) لاحظ انخفاض في قيمة الامتصاصية في الطول الموجي 230 نانومتر بعد تنبيذ فائق CSCL ، مما يشير إلى تحسن في نوعية الحمض النووي الجيني. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية صندوق التنمية ، الجينوم كولومبيا البريطانية ، وكولومبيا البريطانية وزارة الغابات والمراعي لدعم الدراسات الجارية للإنتاجية التربة الغابات. كان مدعوما من قبل SL الزمالة من مركز تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
