العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Summary

Protocol

مجموع إعداد نخاع العظام

1. وضحى أربعة B6 تشريح الفئران والحصول على tibias ، femurs ، والورك والعمود الفقري.
2. خلال التشريح ، يتم الاحتفاظ الأطراف والعظام في الحرارة PBS FCS 2 ٪ المعطل (EDA 2mm والاختيارية -- متوسطة تشريح).
3. وسحقت عظام نظيفة مع مدقة الهاون والمتوسطة في تشريح. وسيلة فعالة لتحقيق ذلك هو سحق tibias ، femurs والوركين كل فأر ، ثم 2 العمود الفقري في كل مرة.
4. يبقى الخليط خلية تم الحصول عليها من كل الماوس منفصلة وتصفيتها من خلال تصفية 40μm في أنبوب الصقر 50ml. بهذه الطريقة ، كل أنبوب يحتوي على خليط الخلية التي تم الحصول عليها من جميع عظام الساق على فأرة الحاسوب ، ونصف من خليط من 2 الحصول على العمود الفقري. في هذه المرحلة ، يتم استخدام فلتر لفصل الحطام العظام.
5. عادة ما يكون من المستحسن لسحق عظام الساق مرتين للحصول على وايت (مع عدم وجود نخاع العظم) شظايا العظام والعمود الفقري وشظايا 2 أو 3 مرات.
6. تملأ أنابيب ليكون لهم متوازنة ، وتدور 1200rpm 5 دقائق.
7. نضح في وطاف تخفيف بيليه عن طريق سحب الأنابيب على الرف الأنبوب (هذه الخطوة الهامة بعد كل الطرد المركزي للحد من تشكيل خلية تتجمع والخسارة). Resuspend في كل أنبوب 1 مل PBS FCS 2 ٪ (NO EDTA من الآن فصاعدا) إذا كنت تفعل استنفاد النسب ، أو في ما هو خلاف ذلك حجم مريحة بالنسبة لك.

نسب استنزاف

1. هذا الإجراء يسمح لك للقضاء على خلايا متباينة للغاية والحصول على مجموعة من السكان غير متجانسة للغاية من الخلايا ، والخلايا الجذعية المخصب لوالسلف. إذا كنت الفرز HSC ، هذه الخطوة تقلل بشكل كبير من عدد من الخلايا التي يجب أن تمر عبر الفرز الخلية ، وبالتالي تقليل وقت الفرز ويسمح لك لفرز HSC من أصل عدد أكبر من الفئران ، وذلك حتى تتمكن من الحصول على عدد أكبر من HSC في واحدة فرز واحد.
2. إذا كنت تسير على الفرز في وقت لاحق ، واخراج 50μl خليط من الخلية (وأنا عادة ما تأخذ قليلا من كل أنبوب) لفرز عناصر تحكم (غير ملوثين وSca1 ، ج ، كيت ، CD48 ، Flk2 الضوابط لون واحد).
3. إضافة لين 30ml/tube كوكتيل. كوكتيل يحتوي على نسب مختلفة من الأجسام المضادة ، والذي يتغير للأسف قليلا من المختبر إلى المختبر. في المختبر Scadden ، ونحن نستخدم الأجسام المضادة ضد biotinilated GR1 ، Ter119 ، CD4 ، CD8 ، CD3 ، B220. التخفيف النهائية في تلطيخ هو 1:700.
4. الدوامة بسرعة إلى المزيج ، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
5. أثناء الحضانة ، وإعداد الأعمدة على المغناطيس وأنابيب شطف 15ml تحت الأعمدة. ديغا بعض PBS باستخدام فلتر steriflip (سترى فقاعات هواء صغيرة تتحرك في اتجاه سطح PBS بسبب الشفط) ، ويوازن الأعمدة من خلال تطبيق برنامج تلفزيوني 3ml degassed إلى كل عمود.
6. تدفق حوالي 1ml/5min العمود ، لذلك يستغرق نحو 15 دقيقة ليكون جاهزا للاستخدام الأعمدة.
7. في نهاية الحضانة ، إضافة PBS FCS 2 ٪ لملء الأنابيب وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 1200rpm.
8. نضح لطاف ، وتخفف من الكريات resuspend في 1 مل / أنبوب degassed برنامج تلفزيوني.
9. إذا كنت الفرز في وقت لاحق ، واخراج مجموع النسب نخاع العظم واحد اللون CTRL تلطيخ (15ml ، قليلا من كل أنبوب).
10. إضافة streptavidin 30ml/tube الخرز ، الدوامة بسرعة إلى المزيج ، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
11. في نهاية الحضانة ، إضافة 2 مل / أنبوب PBS degassed. وضعت مجموعة جديدة أنابيب تحت الأعمدة ، وتطبيق كل تعليق إلى عمود ، والترشيح من خلال مرشح 40μm.
12. إضافة آخر مل 3 من برنامج تلفزيوني degassed إلى كل أنبوب لغسله. مرة واحدة في أعمدة فارغة ، وتطبيق مرة أخرى باستخدام نفس تصفية 40μm.
13. ويحتوي على خليط شطافة النسب الخلية المنضب ، بلغ عدد السكان غير متجانسة المخصب لخلايا الجذعية والأسلاف. تجمع مضمون أنابيب 4 في 2 الأنابيب. تدور لمدة 5 دقائق في 1500rpm.
14. نضح طاف. يجب أن تكون بيضاء أو بيليه الأبيض في المقام الأول. تخفيف الكريات وresuspend معا في برنامج تلفزيوني مجموع 1ml FCS 2 ٪ إذا كنت الفرز في وقت لاحق ، على خلاف ذلك في ما resuspend حجم مريحة بالنسبة لك.

LKS أو طويلة الأجل الفرز HSC

1. اخراج النسب المنضب لون واحد السيطرة تلطيخ (15ml). هذا سيسمح لك لتقييم كفاءة استنفاد النسب الخاصة بك.
2. اتسخت الخليط لفرز الخلية في أنبوب 15ml.

إضافة الأضداد :

SCA PE - Cy5.5	1 : 100	10ML
مجموعة APC	1:100	10ML
SA - PE Cy7	1:500	2ml

لفرز HSC المدى الطويل ، إضافة أيضا :

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

كذلك ، تعد واحدة تلطيخ الضوابط باستخدام نخاع العظم مجموع أبقى جانبا بعد تشريح ونخاع العظم الملون مجموع النسب. ويمكن القيام بهذه stainings مباشرة في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية.

تأكد من أن تكون في الظلام!

1. الدوامة بسرعة لخلط واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة ، في منتصف الطريق من خلال إعادة خلط.
2. ليغسل فائض من الأجسام المضادة ، تملأ أنابيب مع FCS PBS 2 ٪ و 5 دقائق عن الدوران عند 1500 دورة في الدقيقة.
3. إزالة طاف ، resuspend جميع الكريات ونقلها إلى أنابيب جديدة مع قبعات FACS التصفية. قد يستغرق بعض الوقت للحصول على الخلايا من خلال الذهاب الى هذه الفلاتر ، وأنه من المهم تطبيق بعض أكثر برنامج تلفزيوني بعد ذلك لغسل تصفية والتقليل من فقدان الخلية. هذه الخطوة كانت ضرورية لتفادي انسداد فارز ، والذي هو أسوأ كابوس لكل مستخدم الخلية فارز.
4. عندما يوزعون الخلايا إلى الخلية مرفق الفرز ، وتأكد من أن تعد كذلك مع أنبوب مرحبا PBS FCS 10 ٪ حيث سيتم جمع الخلايا.
5. إذا كنت فرز الخلايا LKS ، سوف تحصل على مجموعة من السكان غير المتجانسة التي تحتوي على المدى الطويل والقصير وإعادة إسكانها الأسلاف HSC multipotent. عائد متوسط ​​300000 LKS من 4 الفئران.
6. إذا كنت قد استخدمت أيضا CD48 Flk2 والأجسام المضادة ، يمكنك فصل كل السكان من شهادة الثانوية العامة على المدى الطويل ، القصير الأجل وHSC MPP. LT - HSC هم السكان الأكثر نادرة. متوسط ​​العائد على حوالي 50،000 إلى 60،000 في الفترة من 4 خلايا الفئران.