Summary
Protocol
共有骨髓的准备
- 四B6小鼠牺牲和胫骨，股骨，髋部和脊柱解剖获得。
- 在解剖，四肢和骨骼都保存在PBS 2％FCS的热灭活（可选2MM的EDA - 夹层介质）。
- 干净的骨头被压碎用迫击炮和杵在夹层介质。做一个有效的方法是粉碎一次每只小鼠的胫骨，股骨和髋部，然后2刺。
- 从每个鼠标中获得细胞的混合物被单独存放，并通过50毫升猎鹰管成40微米过滤器过滤。在这种方式中，每管含有细胞的混合物，获得了所有的鼠标，从2棘获得的混合物的一半腿骨。在这个阶段，过滤器是用于单独的骨骼碎片。
- 它通常是最好粉碎腿骨两次获得白（无骨髓）碎骨，脊柱片段2或3倍。
- 填充管他们平衡，旋转5分钟1200RPM。
- 吸上清，松开拖管的管架（每个离心后，以尽量减少聚集形成和细胞的损失，这一步很重要）沉淀。重悬在每管1毫升PBS 2％FCS（没有EDTA从现在开始，）如果你正在做血统的枯竭，或在任何音量，否则您方便。
天堂枯竭
- 此过程可以消除高度分化的细胞，并获得一个非常庞杂的人口细胞，干细胞和祖细胞丰富。如果你是排序的HSC，这一步大幅降低的细胞通过细胞分选去的数量，从而减少排序的时间，并允许排序的HSC较高的小鼠，让你可以得到一个较高的数字的HSC在一个单一的排序。
- 如果你要排序后，取出的细胞混合排序控件（未染色和SCA1，CD48，c - Kit的Flk2单一的颜色控制）（我通常采取从每个管位）50μL。
- 新增林鸡尾酒30ml/tube。天堂鸡尾酒含有多种抗体，不幸变化不大，从实验室到实验室。在Scadden实验室，我们使用biotinilated抗体对GR1，Ter119，CD4 +，CD8 +，CD3 +，B220。他们在染色的最终稀释度为1:700。
- 涡迅速混合，孵育15分钟，在4 ° C。
- 在孵化期间，准备上的磁铁和下15毫升洗脱列管的列。德加一些PBS使用steriflip过滤器（你应该看到迈向由于负压吸引的PBS表面的小气泡），和平衡3毫升脱气PBS每一列列。
- 柱流量约1ml/5min，所以准备使用的列，它大约需要15分钟。
- 在孵化结束，加PBS洗涤2％FCS的填补管和旋转5分钟，在1200RPM。
- 吸出上清液，松开颗粒和悬浮在1毫升/脱气PBS管。
- 如果你是排序后，取出天堂单一颜色的染色CTRL总骨髓（15毫升，每管位）。
- 添加30ml/tube链亲和素珠，涡迅速混合，孵育15分钟，在4 ° C。
- 在孵化结束，加2毫升/管脱气PBS。把下列新的收集管，并适用于每一个暂停一列，通过40微米的过滤器进行过滤。
- 每管加入另3毫升脱气PBS洗。一旦列是空的，再次申请使用相同的40微米过滤器。
- 洗脱液包含枯竭的谱系细胞的混合物，异构的人口为干细胞和祖细胞丰富。游泳池的内容分为2管，4管。在1500RPM旋转5分钟。
- 吸上清。颗粒应为白色或白色为主。如果你是排序后松开颗粒1毫升总PBS 2％FCS一起重悬，否则悬浮在任何音量方便您。
LKS或的长远的HSC排序
- 取出血统耗尽单一颜色的染色CTRL（15毫升）。这将允许您评估您的血统枯竭的效率。
- 15毫升管染色细胞混合排序。
新增抗体：
| SCA PE - Cy5.5 | 1：100 | 10毫升 |
| 包APC | 1:100 | 10毫升 |
| SA的PE - Cy7 | 1:500 | 2毫升 |
要排序长期的HSC，还可以添加：
| CD48 FITC | 1:1000 | 1毫升 |
| Flk2体育 | 1:200 | 5毫升 |
此外，准备单染色控制使用的总预留保持解剖和骨髓血统染色后的骨髓。这些染色法，流式细胞仪管可以直接到。
确保在黑暗中！
- 涡迅速混合，并在4 ° C时20至30分钟，再搅拌中途孵化。
- 洗去多余的抗体，填补了PBS 2％FCS和自旋为5分钟1500转管。
- 去除上清液，重新悬浮颗粒和移动新流式细胞仪管过滤器盖。它可能需要一段时间来获得的细胞经过这些过滤器，重要的是申请多一些PBS事后冲洗过滤器，最大限度地减少细胞损失。这一步是必要的，以避免堵塞的分拣机，这是最可怕的噩梦的每一个细胞分选仪用户。
- 当交给你的细胞，细胞分选设施，确保还准备与PBS 10％您好FCS的细胞，将收集管。
- 如果你是李嘉诚细胞排序，您将获得一个包含长期和短期的复育HSC和多向祖细胞的异质人口。从4只小鼠的平均产量是30万李嘉诚。
- 如果你也用CD48和Flk2抗体，可以单独每一个长期的HSC，短期HSC和MPP人口。 LT - HSC是最难得的人口。平均产量约5万至6万4小鼠的细胞。
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