Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Summary

Protocol

Preparação de medula óssea total de

1. Quatro B6 ratos são sacrificados e dissecados, para obtenção tíbias, fêmures, quadril e coluna vertebral.
2. Durante a dissecção, os membros e os ossos são mantidos em PBS 2% do calor FCS inativada (opcional 2mM EDA - medium dissecção).
3. Os ossos são limpos esmagado com pilão em meio dissecção. Uma maneira eficiente de fazer isso é para esmagar tíbias, fêmures e quadris de cada rato, em seguida, 2 espinhos de cada vez.
4. A mistura de células obtidas de cada rato é mantido separado e filtrado por um filtro de 40μm em um tubo falcon 50ml. Desta forma, cada tubo contém a mistura de células obtidas de todos os ossos da perna de um rato, e metade da mistura obtida a partir de duas lombadas. Nesta fase, o filtro é usado para separar os restos de ossos.
5. Geralmente é aconselhável para esmagar os ossos da perna duas vezes para obter o branco (sem medula óssea) fragmentos de ossos, e os fragmentos espinha 2 ou 3 vezes.
6. Encher os tubos de tê-los equilibrado, e girar 1200rpm 5 min.
7. Aspirar o sobrenadante e soltar a pelota, arrastando os tubos no suporte de tubos (este passo é importante depois de cada centrifugação para minimizar a formação de touceira e perda de células). Ressuspender em cada tubo 1 ml PBS FCS a 2% (NO EDTA a partir de agora) se você estiver fazendo o esgotamento linhagem, ou em qualquer outra forma de volume é conveniente para você.

Esgotamento Lineage

1. Este procedimento permite eliminar as células altamente diferenciadas e obter uma população bastante heterogênea de células, enriquecido de células-tronco e progenitoras. Se você está classificando HSC, esta etapa reduz drasticamente o número de células que têm de passar pela separação de células, portanto, reduzindo o tempo de triagem e permitindo-lhe ordenar HSC de um maior número de ratos, de modo que você pode obter um maior número de HSC em uma classificação única.
2. Se você estiver indo para classificar mais tarde, tirar 50μl da mistura de celular (eu costumo levar um pouco de cada tubo) para classificar os controles (sem manchas e SCA1, c-Kit, CD48, Flk2 controles de cor única).
3. Adicionar Lin 30ml/tube cocktail. Cocktail linhagem contém uma variedade de anticorpos que, infelizmente, muda um pouco de laboratório para laboratório. No laboratório Scadden, usamos anticorpos biotinilado contra Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Sua diluição final na coloração é 1:700.
4. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 15 min a 4 ° C.
5. Durante a incubação, preparar as colunas sobre os ímãs e tubos de eluição 15ml sob as colunas. Degas alguns PBS usando um filtro steriflip (você deve ver as bolhas de ar pouco se movendo em direção à superfície da PBS, devido à aspiração a vácuo), e equilibrar as colunas, aplicando 3 ml PBS desgaseificados a cada coluna.
6. O fluxo da coluna é sobre 1ml/5min, por isso leva cerca de 15 min para ter as colunas prontas para uso.
7. No final da incubação, adicionar 2% PBS FCS para encher os tubos e spin down de 5 minutos a 1200rpm.
8. Aspirar o sobrenadante, solte os pellets e ressuspender em 1 ml / tubo desgaseificados PBS.
9. Se você está a classificação depois, tirar da medula óssea total de Lineage única cor coloração ctrl (15ml, um pouco de cada tubo).
10. Adicionar estreptavidina contas 30ml/tube vortex, rapidamente para misturar e incubar por 15 min a 4 ° C.
11. No final da incubação, adicionar 2 ml / tubo de PBS desgaseificados. Colocar tubos de coleta de novo sob as colunas, e aplicar cada suspensão a uma coluna, filtrando por um filtro de 40μm.
12. Adicionar outro de 3 ml de PBS a cada tubo desgaseificados para lavá-lo. Uma vez que as colunas estão vazias, aplique novamente usando o mesmo filtro 40μm.
13. O eluído contém a mistura de células de linhagem empobrecido, uma população heterogênea enriquecido para células-tronco e progenitores. Piscina o conteúdo da 4 tubos em 2 tubos. Rodada por 5 min a 1500rpm.
14. Aspirar o sobrenadante. O pellet deve ser branco ou principalmente branco. Solte os pellets e ressuspenda-los juntos em 1ml total de PBS FCS 2% se você está ordenando depois, de outra forma ressuspender em qualquer volume é conveniente para você.

LKS ou classificação HSC a longo prazo

1. Retire linhagem esgotada única cor coloração ctrl (15ml). Isto permitirá que você para avaliar a eficiência de seu esgotamento linhagem.
2. A mistura de células para classificar está manchada no tubo de 15ml.

Adicionar anticorpos:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA-PE Cy7	1:500	2ml

Para classificar HSC a longo prazo, também acrescentar:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

Além disso, prepare coloração única controles usando a medula óssea total mantido de lado após a dissecção eo total de osso manchado linhagem de medula. Estas colorações pode ser feito diretamente em tubos FACS.

Certifique-se de ficar no escuro!

1. Vortex rapidamente para misturar e incubar a 4 ° C por 20 a 30 minutos, a meio caminho através de re-mistura.
2. Para lavar o excesso de anticorpos, encher os tubos com PBS FCS 2% e girar por 5 min a 1500 rpm.
3. Remover o sobrenadante, ressuspender todos os pellets e movê-los para novos tubos com tampas FACS filtro. Pode demorar um pouco para obter as células que passar por esses filtros, e é importante aplicar um pouco mais tarde PBS para lavar o filtro e minimizar a perda de células. Esta etapa é necessária para evitar o entupimento do classificador, que é o pior pesadelo de todos os usuários classificador de celular.
4. Ao distribuir suas células para a instalação separação de células, certifique-se também preparar um tubo com PBS a 10% HI FCS onde as células serão coletadas.
5. Se você está ordenando as células LKS, você obterá uma população heterogênea contendo prazo curto e longo repovoamento progenitores HSC e multipotentes. Um rendimento médio é de 300.000 LKS de 4 camundongos.
6. Se você tiver usado também CD48 e Flk2 anticorpos, você pode separar cada população de HSC a longo prazo, curto prazo e HSC MPP. LT-HSC são a população mais raros. Um rendimento médio é de cerca de 50.000 a 60.000 células de quatro camundongos.