Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

Summary

Protocol

Totalt benmärg förberedelse

1. Fyra B6 möss offras och dissekeras för att få skenben, lårben, höft och ryggrad.
2. Under dissektioner, är armar och ben och benen hålls i PBS 2% FCS värmeinaktiverad (tillval 2mm EDA - dissektion medium).
3. De rena ben krossas med mortel i dissektion medium. Ett effektivt sätt att göra det är att krossa skenben, lårben och höfter på varje mus, sedan 2 ryggar åt gången.
4. Cellen blandningen från varje musen hålls separat och filtreras genom en 40μm filter till en 50 ml falk rör. På detta sätt innehåller varje rör cellen blandning som erhålls ur alla ben ben en mus, och hälften av blandningen från 2 ryggar. I detta skede är det filter som används för att separera ben skräp.
5. Det är oftast lämpligt att krossa ben ben två gånger för att få vita (utan benmärg) benfragment, och ryggraden fragment 2 eller 3 gånger.
6. Fyll rören att ha dem balanserade, och snurra 5 min 1200rpm.
7. Aspirera supernatanten och lossa pellets genom att dra rören på provrörsställ (detta steg är viktigt efter varje centrifugering för att minimera klumpar bildas och cell förlust). Resuspendera varje rör i 1 ml PBS 2% FCS (NO EDTA från och med nu) om du gör härstamning utarmning, eller i vilken volym annars är bekvämt för dig.

Lineage utarmning

1. Detta förfarande gör att du kan eliminera mycket differentierade celler och få en mycket heterogen population av celler, berikad av stamceller och progenitorceller. Om du sorterar HSC, minskar detta steg drastiskt antalet celler som måste gå igenom cellen sortering, vilket minskar sortering tid och gör att du kan sortera HSC av ett större antal möss, så att du kan få ett högre antal HSC i en enda sortering.
2. Om du ska sortera senare ta ut 50μl av cell blandning (jag brukar ta lite från varje rör) för att sortera kontroller (ofärgade och Sca1, c-Kit, CD48, Flk2 enda färg kontroller).
3. Lägg till Lin cocktail 30ml/tube. Lineage cocktail innehåller en mängd antikroppar, som tyvärr ändrar lite från labb till labb. I Scadden labbet använder vi biotinilated antikroppar mot Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Deras sista utspädning i färgningen är 1:700.
4. Vortex snabbt att blanda och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
5. Under inkubation, förbereda kolumnerna på magneter och 15ml rör eluering i kolumnerna. Degas några PBS med hjälp av en steriflip filter (du bör se lite luftbubblor rör sig mot ytan av PBS grund vakuumaspiration) och balansera kolumnerna genom att tillämpa 3ml avgasad PBS till varje kolumn.
6. Kolumnen Flödet är ca 1ml/5min, så det tar ca 15 min att få kolumner klar att använda.
7. I slutet av inkubationen, tillsätt PBS 2% FCS att fylla rören och spinn ner i 5 min vid 1200rpm.
8. Aspirera supernatanten, lossa pellets och återsuspendera i 1 ml / tub avgasade PBS.
9. Om du sorterar senare, ta ut totalt benmärgen Lineage enda färg färgning ctrl (15ml, lite från varje rör).
10. Lägg streptavidin pärlor 30ml/tube, vortex snabbt att blanda och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
11. I slutet av inkubationen, tillsätt 2 ml / tub avgasade PBS. Sätt ny kollektion rören i kolumnerna, och tillämpa varje suspension till en kolumn, filtrering genom en 40μm filter.
12. Lägg till ytterligare 3 ml avgasad PBS till varje rör för att tvätta den. När kolumnerna är tomma, ansöka igen med samma 40μm filter.
13. Eluatet innehåller härstamning utarmat cellen blandning, en heterogen befolkning berikad för stamceller och progenitorceller. Pool innehållet i 4 rör i 2 rör. Spin i 5 min vid 1500rpm.
14. Sug ut supernatant. Den pellets ska vara vit eller huvudsakligen vita. Lossa pellets och återsuspendera dem tillsammans i 1 ml totalt PBS 2% FCS om du sorterar senare, annars återsuspendera oavsett i vilken volym är bekvämt för dig.

LKS eller lång sikt HSC sortering

1. Ta ut härstamning utarmat enda färg färgning ctrl (15ml). Detta gör att du kan bedöma effektiviteten i din härstamning utarmning.
2. Cellen blandningen sortera färgas i 15ml tub.

Lägg antikroppar:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2ml

Om du vill sortera långsiktiga HSC, även lägga till:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

Dessutom förbereder enda färgning kontroller med den totala benmärgen höll undan efter dissektion och den totala benmärgen härstamning fläckig. Dessa stainings kan göras direkt i FACS rör.

Se till att vara i mörkret!

1. Vortex snabbt att blanda och inkubera vid 4 ° C i 20 till 30 minuter, åter blanda halvvägs.
2. Att tvätta bort överskottet av antikroppar, fylla rören med PBS 2% FCS och snurrar i 5 minuter vid 1500 rpm.
3. Avlägsna supernatanten, återsuspendera alla pellets och flytta dem till nya FACS rör med filter mössor. Det kan ta ett tag att få cellerna att gå igenom dessa filter, och det är viktigt att använda lite mer PBS efteråt att tvätta filtret och minimera cell förlust. Detta steg är nödvändigt för att undvika igensättning av sorterare, vilket är den värsta mardröm för varje cell sorterare användare.
4. När dela ut dina celler till cellen sorteringsanläggning, se till att också utarbeta en tub med PBS 10% HI FCS där cellerna kommer att samlas in.
5. Om du sorterar LKS celler, kommer du få en heterogen befolkning med långsiktiga och kortsiktiga återinplantering HSC och multipotenta stamceller. En genomsnittlig avkastning är 300.000 LKS från 4 möss.
6. Om du har också använt CD48 och Flk2 antikroppar kan du separera varje population på lång sikt HSC, kortsiktiga HSC och MPP. LT-HSC är de mest sällsynta befolkningen. En genomsnittlig avkastning är ca 50.000 till 60.000 celler från 4 möss.