İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH'lerin)

Summary

Protocol

Toplam kemik iliği hazırlık

1. Dört B6 fareler kurban ve tibiaları, femur, kalça ve omurga elde etmek için disseke.
2. Diseksiyonlar sırasında, bacaklarda ve kemiklerin PBS% 2 FCS ısı inaktive tutulur (isteğe bağlı 2mm EDA - diseksiyonu orta).
3. Temiz kemikleri diseksiyonu orta havanda ezilir. Bunu yapmak için etkili bir yolu, bir süre sonra her fare tibiaları, femur ve kalça, 2 dikenler ezmek için.
4. Her fare elde edilen hücre karışımı ayrı tutulur ve 50ml şahin tüpe 40μm filtre süzülür. Bu şekilde, her tüp, bir fare ve 2 dikenler elde edilen karışımın yarısı tüm bacak kemiklerinin elde edilen hücre karışımı içerir. Bu aşamada, filtre kemik enkaz ayırmak için kullanılır.
5. Bacak kemiklerinin ezmek için iki kez (kemik iliği olmadan) kemik parçaları beyaz elde etmek için genellikle tavsiye edilir, ve omurga parçaları 2 veya 3 kez.
6. Onları dengeli olması tüpler doldurun ve 5 dakika 1200rpm dönmeye.
7. Süpernatantı aspire ve tüpler tüp raf (bu adım tutam oluşumu ve hücre kaybını en aza indirmek için her santrifüj sonra önemli) sürükleyerek pelet gevşetin. Her tüpe 1 ml PBS% 2 FCS (artık NO EDTA), soy tükenmesi yapıyorsun süspanse edin, ya da başka hacmi ne olursa olsun sizin için uygun.

Lineage tükenmesi

1. Bu prosedür, son derece farklılaşmış hücrelerin ortadan kaldırmak ve bir hücre çok heterojen bir nüfus elde, kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiş sağlar. HSC sıralama ise, bu adım büyük ölçüde, bu nedenle sıralama süresini azaltmak ve böylece daha yüksek bir sayı elde farelerin daha yüksek bir sayı HSC dışarı sıralamak için izin hücre sıralama üzerinden gitmek zorunda hücrelerinin sayısını azaltır HSC tek bir sıralama.
2. (Boyasız ve SCA-1, c-Kit, CD48, Flk2 tek renk kontrolleri) sıralama kontrolleri için hücre karışımı (Ben genellikle her tüpten biraz) daha sonra sıralamak için gidiyoruz, 50μl çıkarın.
3. Lin kokteyl 30ml/tube ekleyin. Lineage kokteyl laboratuvardan laboratuvara ne yazık ki küçük değişiklikler çeşitli antikorlar içerir. Scadden laboratuvarda, B220 biotinilated Gr1 karşı antikorlar Ter119, CD4, CD8, CD3, kullanın. Boyama Onların son seyreltme 1:700.
4. Vorteks hızlı karıştırın ve 4 az 15 dakika boyunca inkübe ° C
5. İnkübasyon sırasında, sütunların altında mıknatıslar ve 15ml elüsyon tüpler sütunları hazırlar. Degas bazı PBS steriflip filtre (vakum aspirasyon nedeniyle PBS yüzeyine doğru hareket eden küçük hava kabarcıkları görmelisiniz) kullanarak ve her sütun 3ml gazlar PBS uygulayarak sütunlar dengelenmesi.
6. Sütun akış 1ml/5min hakkında, bu nedenle kullanıma hazır sütunların yaklaşık 15 dakika sürer.
7. Inkübasyon sonunda tüplerin doldurulması ve 1200rpm az 5 dakika boyunca aşağı döndürmek için PBS% 2 FCS ekleyin.
8. Süpernatantı aspire pelet gevşetin ve 1 ml / tüp PBS gazlar tekrar süspansiyon haline getirin.
9. (15ml, her tüp bir bit), daha sonra sıralama tek renk boyama ctrl Lineage toplam kemik iliği çıkarmak.
10. Streptavidin boncuk hızlı 30ml/tube, girdap karıştırın ve 15 dakika boyunca inkübe 4 ° C
11. Inkübasyon sonunda, 2 ml / tüp gazlar PBS ekleyin. Sütunların altında yeni toplama tüpleri koyun ve 40μm bir filtre ile filtreleme, bir sütun her süspansiyon uygulamak.
12. Yıkamak için her tüp gazlar PBS başka bir 3 ml ekleyin. Sütunlar boş sonra yine aynı 40μm filtre kullanılarak uygulanır.
13. Eluat soyu tükenmiş hücre karışımı, kök ve progenitörlerin hücrelerin zenginleştirilmiş heterojen bir nüfus içerir. 2 tüp içine 4 tüplerin içerik Havuzu. 1500rpm az 5 dakika boyunca dönerler.
14. Süpernatant aspire. Pelet beyaz ya da ağırlıklı olarak beyaz olmalıdır. Daha sonra sıralama pelet gevşetin ve onları bir araya tekrar süspansiyon PBS% 2 FCS 1ml toplam hacmi ne olursa olsun sizin için uygun, aksi takdirde tekrar süspansiyon haline getirin.

LKS ya da uzun vadeli HSC sıralama

1. Tükenmiş tek renk boyama ctrl (15ml) soyundan dışarı atın. Bu soy tükenmesi verimliliğini değerlendirmek için izin verecektir.
2. 15ml tüp sıralamak için hücre karışımı lekeli.

Antikorlar ekle:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2ml

Uzun vadeli HSC sıralamak için, aynı zamanda ekleyin:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

Ayrıca, tek boyama, diseksiyonu ve total kemik iliği soy boyandı sonra bir kenara tutulan toplam kemik iliği kullanılarak kontrol hazırlamak. Bu renklendirmeler FACS tüpler doğrudan yapılabilir.

Karanlık olmak için emin olun!

1. Vorteks 4 ° C 20 ila 30 dakika, yeniden karıştırma yarım yoluyla hızlı bir şekilde karıştırın ve inkübe için.
2. Antikor aşırı yıkamak için, 1500 rpm'de 5 dakika süreyle PBS% 2 FCS ve spin tüpleri doldurmak.
3. Süpernatantı pelet tekrar süspansiyon ve filtre kapakları ile yeni FACS tüpler taşıyabilirsiniz. Bu filtreleri geçmek hücreleri elde etmek için bir süre alabilir ve filtre yıkayın ve hücre kaybını en aza indirmek için daha sonra PBS biraz daha uygulamak için önemlidir. Bu adım sıralayıcı tıkanmasını önlemek için gerekli olan her hücre sıralayıcı kullanıcı en kötü kabus.
4. Hücreleri hücre sıralama tesisine teslim zaman, hücreler alınır PBS% 10 HI FCS ile de bir tüp hazırlamak için emin olun.
5. LKS hücreleri sıralama iseniz, uzun vadeli ve kısa vadeli HSC ve multipotent atalarıdır repopulating içeren heterojen bir nüfus elde edecektir. 4 farelerden alınan ortalama verim 300.000 LKS.
6. Ayrıca CD48 ve Flk2 antikorları varsa, her nüfus, uzun vadeli HSC, kısa vadeli HSC ve MPP ayırabilirsiniz. LT-HSC en nadir nüfus. 4 farelerden alınan ortalama verim yaklaşık 50.000 ila 60.000 hücreleri.