Summary
A montagem de um microscópio nearfield infravermelho para os agregados da proteína de imagem é descrito.
Abstract
Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na montagem e operação de um microscópio de campo próximo infravermelho para imagens além do limite de difração. O microscópio de campo próximo apertureless é um instrumento de espalhamento de luz do tipo que fornece espectros de infravermelho em cerca de 20 nm resolução. Uma lista completa de componentes e um protocolo passo a passo para uso é fornecida. Erros comuns na montagem e afinação do instrumento são discutidas. Um conjunto de dados representativos que mostra a estrutura secundária de uma fibrilas amilóides é apresentado.
Protocol
Background:
Apertureless sonda campo próximo microscopia IR oferece imagens de alta resolução espacial. É uma técnica relativamente nova em que um feixe de infravermelho incidente é espalhada por um microscópio de força atômica afiada ponta (AFM) oscilando na freqüência de ressonância do cantilever perto da amostra. Um detector de IR coleta luz espalhada e é demodulado nesta freqüência de ressonância ou seus harmônicos. Desta forma, a dispersão do segundo plano do incidente focado feixe de laser sobre o resto da superfície da amostra pode ser reduzida e uma resolução espacial muito além do limite de difração da luz pode ser alcançado para obter contraste infravermelho com resolução espacial em nanoescala i, ii, iii . Desde o ápice da ponta do AFM é muito menor do que a área focal do feixe de laser, a luz espalhada é fraca. A fim de reforçar este campo espalhado, detecção homódinas é usado quando um campo de referência é adicionado ao campo coletados dispersa e da fase relativa dos campos é definida como a interferência que construtiva máxima ocorre no detector. A intensidade de espalhamento é então proporcional à magnitude do campo elétrico de referência iv, v, vi. Uma questão importante no campo próximo de imagem é para evitar artefatos produzidos pelo z-movimento da ponta do AFM vii, viii, ix, x, xi. Este problema pode ser reduzido com o ajuste adequado da fase homódinas e excluindo grandes características topográficas, como já demonstrado por Mueller et al. Esta técnica é, então, de forma confiável usado para obter o espectro de espalhamento experimental de materiais com uma resolução espacial de menos de 30 nm 15 . O uso de microscopia de campo próximo de materiais biológicos foi anteriormente demonstrado, particularmente para macromoléculas, como o tabaco mosaic virus xii e bactérias E. Coli xiii.
Neste relatório, ilustramos a montagem de um tal dispositivo de imagem. Apresentamos também informações de estrutura secundária de fibrilas amilóides formado a partir do fragmento # 21-31 peptídeo de β 2-m obtidos por campo próximo apertureless microscopia eletrônica de varredura de infravermelho (ANSIM). De campo próximo imagens são coletados simultaneamente com topografia, permitindo a detecção e coleta do espectro de espalhamento de fibrilas individuais.
Nosso apertureless varredura de campo próximo infravermelho microscópio (ANSIM) medições é um dispositivo caseiro. O esquema da instalação experimental é mostrado no Esquema 1. Um microscópio AFM (Multimodo, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA) é usado para medir a topografia da amostra, bem como produzir a dispersão de campo próximo reforço modulada na freqüência de oscilação da ponta. Tocando modo de platina revestido, NSC14/Ti-Pt cantilevers (MicroMasch, Estónia) são usados para melhorar a dispersão do contínuo, sintonizável IR laser (faixa de freqüência: 2000 cm -1 a 1600 cm -1, PL3 laser de gás CO, Edinburgh Instruments, Grã-Bretanha), perto da superfície. A hélio neon laser (Melles Griot, Albuquerque, NM) campo é usado como um guia para a radiação infravermelha invisível. A luz do laser infravermelho é propagado no sentido de uma lente, depois de passar um refletor ZnSe parcial. É então concentraram-se no ápice da ponta oscilante AFM, com a polarização do feixe de paralelas ao longo eixo da sonda. A radiação IR recolhido pela lente é então adicionado a um sinal homódinas referência. Um espelho parabólico é usado para focalizar a radiação IR em um telureto de cádmio mercúrio (MCT) detector de infravermelhos (Infrared Graseby, Orlando, FL). Um driver piezo (Thorlabs, Newton, NJ) é utilizado para maximizar o sinal detectado, corrigindo a fase da luz homódinas. A maioria dos componentes ópticos descritos acima são solidamente fixado em uma plataforma e mudou na XY ou Z posições usando um estágio de translação. A fração de AC do sinal detectado é transmitida a um amplificador lock-in (modelo SR844 RF, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA), que demodula o sinal na freqüência de oscilação da ponta. A intensidade de espalhamento é observada como a ponta do AFM varre a superfície da amostra e os dados da topografia é obtida simultaneamente. O software utilizado para a coleta de dados e imagem é Nanoscope V5.31r1 (Veeco Instruments, Santa Barbara, CA).
Scheme1 
Figura 1 - mostra as partes do sistema de imagens, cuja montagem e utilização descreveremos 
0) tabela Optical
1) Base de Dados de MM AFM
2 Scanner) da MM AFM
3) breadboard elevados óptica
(13 "x 18" x 3 / 8 ", Thorlabs)
4) espelhos Orientadores (revestido de ouro, um "dia.)
7) tubo óptico utilizado para garantir instalação da plataforma de elevação (17)
8) O objectivo IR
(FL 16 mm, NA 0,28, Ealing)
9) do tubo óptico para coletado luz back-espalhados
10 Cube) w / fora do eixo espelho parabólico
(90 °, FL 5 ", Janos)
11 Cube) para manter placa Ge @ 45 °
12 ocular Microscope) (x10)
13) XY palco montado pinhole (0,5 mm)
14) MCT IR detector (Graseby Infrared)
15) IR preamp detector (AC e DC)
16) XY palco para mover a posição do feixe
17) Elevar tabela para focar o feixe
18) Z-estágio para posicionar o detector IR
19) X-estágio para posicionar o detector IR
Assembléia etapa I.1
Montar a configuração óptica e espelhos com ajuste e posição do Hélio-Neon feixe paralelo (HeNe) para a tabela óptica (0) na altura aproximadamente correta (H) acima da breadboard óptica (3) ea distância (D) a partir do centro do scanner (2).
Esta altura H ea distância D pode ser estimada a partir da altura (H1) da amostra em cima do scanner (2) da tabela óptica, ângulo desejado de incidência (α), altura do topo da breadboard acima da tabela óptica (h), tamanhos geométrica do cubo óptico e objetiva IR (6 e 8 na Figura 1) ea distância de trabalho do objectivo IR (todos juntos d, aqui d = 1 "2" +2 ")
Figura 2 
H = H1 + d * sin (α)-h
D = d * cos (α)
Assembléia I.2 passo
Figura 3 
Figura 3: Sem os refletores no cubo (5) e com o tubo óptico alongado na outra extremidade do cubo (6) direta He-Ne feixe através da íris anexados nas extremidades dos tubos.
Montagem passo I.3
Figura 4 
Figura 4: Com o scanner (2) removido, anexar o longo tubo óptico com a íris no final no lugar do objectivo IR. Insira o refletor ZnSe parcial para direcionar o feixe em direção à amostra percorrendo o longo tubo óptico. O refletor ZnSe parcial deve ser montado de tal forma que o feixe de HeNe atinge a superfície frontal do refletor no centro geométrico do cubo óptico segurando o refletor parcial.
Figura 5 
Figura 5: Ao girar o refletor parcial, direcionar o feixe de HeNe através da íris de saída fechado. Desde a montagem do refletor parcial não prendê-lo exatamente perpendicular, existem dois parafusos de ajuste home-instalado, permitindo o movimento vertical do feixe. Use os se necessário.
Figura 6 
Montagem passo I.4
Figura 6. Monte o espelho parabólico com borracha O-rings no cubo óptico (ver 1, Figura 5). Apertando os parafusos, os O-rings comprimir, permitindo o ajuste do espelho.
Figura 7 
Com espelhos adicionais (um é mostrado na Figura 7) direcionar o feixe de HeNe na direção oposta, como ilustrado na Figura 7. Ajustar o feixe para passar através da íris usado anteriormente. Este feixe será usado para ajustar o espelho parabólico.
Figura 8 
Figura 8: Um espelho parabólico colocado no cubo óptico (10) reflete a luz em direção a posição do detector. Parafusos de ajuste de direcionar o feixe através do pinhole colocado na saída do cubo (11), que irá realizar o germânio janela (Ge). Depois que o feixe é ajustado através do furo, coloque o d MCTetector perto do pinhole. Ajustar a posição do detector IR tal que He-Ne feixe é no elemento de detecção do detector. Mova o detector para baixo por aproximadamente 2 mm (IR feixe serão deslocados para baixo pela janela Ge).
Montagem passo I.5
Figura 9 
Figura 9: Insira o mount com janela Ge em cubo óptico (11). O anti-reflexo (AR) Janela Ge revestido serve como um filtro IR e observações permite visual do cantilever ea amostra. Anexar a ocular (12). Torcendo ângulo do cubo (11) com relação ao cubo (10) permite que um ponto a ocular na direção desejada. Girando a montagem da janela de Ge, o feixe de HeNe é dirigido pelo meio da ocular.
Figura 10 
Figura 10: Ligue IR objetivo (8) e AFM scanner (2). Anexar o beamstop até o final de saída do tubo óptico (5). Use um filtro de proteção ao ver o feixe de HeNe através da ocular. A posição de uma amostra no scanner e direcionar o feixe de HeNe através do tubo de entrada óptica (5). Verifique se o feixe de HeNe é grande o suficiente para derramar sobre o beamstop. O beamstop é usada porque o objectivo Cassegrain, que só recolhe a luz recebida da periferia do feixe. Ao ajustar o fio da ocular uma imagem nítida do feixe de HeNe focado na amostra é obtida.
Montagem passo I.6
Um ajuste final de espelho parabólico é necessária. O pinhole saída é substituído com a íris na posição focal do espelho parabólico. Remova a janela do Ge e detector IR (marca posição do detector IR!). Anexar uma lente adicional após a íris na duração aproximada focal da lente da íris. Neste momento, o cantilever envolvidos devem ser visíveis através da lente. Ajustar a posição do espelho parabólico para o centro no final da ponta através da íris fechado. Note que quando o feixe está corretamente focado HeNe na ponta, faz um brilho brilhante entre a ponta e é uma reflexão sobre a superfície da amostra. Recoloque a janela Ge; ajustá-lo para observação visual conveniente do cantilever. Substituir a íris com a pinhole e lembre-se que a pinhole usado para detecção de IR deve ser deslocada fora do centro devido ao deslocamento do feixe de infravermelho pela janela Ge. Coloque o detector IR na posição previamente marcada.
Por fim, direcionar o feixe de IR de modo que viaja junto com o feixe de HeNe visível usado para o tuning.
Agora tudo deve estar pronto para o ajuste de rotina.
Ajuste de rotina:
Etapa de ajuste A.1:
Alinhamento com HeNe-Laser
É mais fácil alinhar com o HeNe visível (632nm) do que com o IR invisível (cerca de 6μm).
O caminho do HeNe e dos feixes IR reúnem-se no espelho inclinável. Se esse espelho é inclinado para baixo a HeNe pode passar, se o espelho está na posição do feixe de IR se propaga para a configuração de campo próximo. Para o alinhamento de uma das vigas apenas, use não os dois espelhos em comum com o outro caminho e estão localizados na frente do espelho inclinável. Se você tiver movido acidentalmente outro espelho, em primeiro lugar tentar trazer de volta para este espelho na sua posição de idade.
A.1.1. Alinhamento grosseira com dois espelhos
Use os dois espelhos perto do laser de HeNe para alinhar o feixe através de todas as íris ao longo do caminho para o estágio de campo próximo. Se você olhar para o feixe no braço homódinas, um perfil do feixe corona-like deve ser observado (devido ao bloqueador de feixe no tubo óptico). Isso indica que o feixe passa direto através dos tubos.
A1.2. Alinhamento com multa de campo próximo Stage
Anexar a cabeça AFM e envolver a ponta cantilever sobre a amostra. Focalizar o feixe de HeNe sobre o fim do cantilever de imagem. Se desloca para fazer o raio a partir do meio do tubo de entrada óptica (5) repita os passos de sintonia A.1. e A.1.2. até que o feixe está centrada.
Movendo o estágio de translação óptica, a objetiva do microscópio refletindo é ajustado para focalizar a luz no ápice da ponta do cantilever, onde ele é espalhado.
Gire o espelho Ge abaixo da ocular (localizado no cubo óptica) e olhar através da ocular. O feixe é focado neste momento (ou no detector de IR, quando o espelho Ge é puxado para fora do cubo) pelo espelho parabólico. Mover o palco para trás ou para frente até que uma imagem nítida da ponta e seu reflexo na superfície da amostra é observada. Use os dois ohá direções (cima / baixo e direita / esquerda) para colocar a ponta do AFM aproximadamente no meio da ocular.
Olhando através de um telescópio, o cantilever de AFM e sua ponta é observado. Novamente, lembre-se de usar um filtro de proteção ao ver o feixe de HeNe. Sem o feixe de HeNe, parte da luz vermelha ainda é observado que se origina a partir da luz interna do controle de distância AFM. Mover o estágio de translação em uma direita-esquerda e / ou up-down direção até um brilho vermelho brilhante é observado no ápice da ponta. Se o alinhamento é bastante ruim, mover o palco para a esquerda da AFM e mover para a direita lentamente. Preste atenção para uma reflexão vermelho se movendo pela superfície da amostra reflexivo. Se o reflexo vermelho ainda não é observada, traduzir o palco para a esquerda novamente e seguir de forma up-down. Mantenha traduzir esquerda-direita, de cima para baixo, até que um brilho vermelho é observado como você se concentrar o feixe de HeNe no ápice da ponta do AFM.
A1.3. Sobreposição do campo homódinas com luz difusa
Abrir o braço e olhar homódinas completa da ocular. Três ou mais pontos em uma linha com intensidade decrescente é visto e essas manchas são o resultado de múltiplas reflexões na frente e traseiras da ótica diferente. Mova o espelho no braço homódinas para que o segundo lugar (do fundo e na intensidade) coincide com a imagem clara da ponta, que é onde a ponta e seu reflexo estão se unindo.
A1.4. A posição do detector
Retire o espelho Ge eo feixe HeNe deve ir na direção onde o detector IR está localizado. Por trás do tubo óptico, dois pontos são observados em forma de anel. O segundo lugar (em intensidade) é o local que deve passar pelo buraco da folha de protecção contra o calor na face do detector IR. O local com maior intensidade deve ser visto na fronteira do buraco.
A1.5. Mudando de uma amostra para outra
Depois de alterar a amostra a ponta do AFM não está mais na mesma posição de antes, mas não deve ser muito longe. Inicie com a etapa A.1.2, desde que a diferença não é normalmente muito grande.
Nota: Se o alinhamento estiver desligado, verifique se o feixe de HeNe ainda passa por todas as íris e cria um brilho vermelho brilhante na ponta AFM. Às vezes você não percebe que você tocou e, portanto, mudou-se um espelho de sua posição original. Se o alinhamento ainda é ruim, infelizmente, o procedimento de alinhamento todo tem que ser completado novamente.
Etapa de ajuste 2: Alinhamento de Feixe IR
Use uma linha de laser de CO com uma alta intensidade / potência (pelo menos 100 mW), pois isso fará com que o alinhamento mais fácil. Preencher o detector com nitrogênio líquido e deixá-lo estabilizar durante pelo menos 30 minutos.
2.1. Alinhamento grosseira com dois espelhos
Coloque um medidor de energia atrás da íris primeiro para monitorar o poder do feixe de IR de entrada. Em seguida, ajuste o espelho que está localizado em frente ao espelho inclinável para obter a leitura mais alta potência. Leve o medidor de energia e mantê-lo atrás da íris, que é o mais próximo ao palco de campo próximo e ajustar o espelho inclinável até uma leitura potência máxima é obtida. Repita este passo algumas vezes para o ajuste ideal.
2.2. Assistindo o sinal 1-F
A referência do amplificador lock-in deve ser definido para o isolar a freqüência da freqüência de oscilação da ponta, definindo-a 1F (ext.), que é a freqüência de oscilação AFM. Definir o tamanho de digitalização em modo de força na trama software Nanoscope a 3 mm. Após o ajuste grosseiro em 2.1., Olhar para a forma correta do sinal 1F. Em seguida, ajustar a fase entre a luz espalhada coletados a partir da ponta ea luz homodyned do braço homódinas ajustando o driver piezo. Isso leva o espelho no braço homódinas Ao alterar a tensão do piezo de modo que o primeiro mínimo do sinal 1F é de cerca de 500 nm a partir de zero. Porque cada mudança no alinhamento irá alterar o comprimento de ambos os caminhos de luz e, portanto, suas fases relativa, a fase precisa ser corrigido com o piezo.
| O que você vai ver (1f sinal)? | |
| Alinhamento ruim: | Duas colisões na M z 3 tamanho da digitalização será observado. |
| Alinhamento médio: | A curvatura da colisão primeiro procura um pouco mais côncava que convexa e segundo a colisão é menor do que o primeiro. |
| (Quase) Alinhamento Bom: | Duas colisões serão observados. A primeira colisão é maior do que a colisão em segundo lugar, ea curvatura no lado direito da primeira colisão será negativo (côncavo). |
| O que fazer para o alinhamento? | |
| Mau alinhamento: | Repita o procedimento de alinhamento na etapa 2.1, conforme necessário. Porque o diâmetro do feixe de infravermelho é grande, a maior parte do feixe passará a íris, mesmo que não está perfeitamente alinhado. Mesmo se duas colisões ainda são observados, o valor do sinal 1F pode ser aumentada por meio do ajuste um ou de ambos os espelhos de alinhamento. Preste atenção para pequenas mudanças na curvatura da colisão primeiro. Acima de tudo, seja paciente pois esta é a parte mais difícil do alinhamento. |
| Alinhamento médio: | Tente ajustar um ou de ambos os espelhos de alinhamento para obter um alinhamento quase bom. Tente mover o estágio de translação XYZ também, mas ajustando-o por incrementos muito pequenos. |
| (Quase) Alinhamento Bom: | Ajustar os espelhos e tentar aumentar o máximo da primeira colisão. 1F sinais são geralmente cerca de 8 a 16 V, para as potências de entrada baixa é menos. Mudar a fase, mudando a tensão usando o driver piezo de modo que o primeiro mínimo se aproxima de zero. Se houver um sinal significativo 1F, mude a referência do amplificador lock-in para isolar o sinal de 2F. Uma parte do sinal deve ser observado e tentar melhorá-lo um pouco mais por muito ligeiramente ajuste dos espelhos e mudar a fase. |
2.3. Mudando de uma amostra para outra
Execute Passo A.1.5 sob o alinhamento do feixe de HeNe. Envolver a ponta do AFM e propagar o feixe de IR através do microscópio. Assista o sinal 1F. Se um sinal 1F ainda é observado, ajustar o espelho inclinável e ajustar a fase. Um bom sinal de IF e, portanto, um bom sinal 2F ainda podem ser observados. Se não, finamente alinhar o feixe utilizando passo 2.2.
Resultados representativos:
Preparação da Amostra O peptídeo # 21-31 foi sintetizado no Centro de Biotecnologia e Bioengenharia da Universidade de Pittsburgh e purificado (> 95%) por HPLC. Para sintetizar as fibrilas amilóides, 0,8 mg de TMAO (Sigma-Aldrich) foi adicionada a uma solução de 1 mM # peptídeo 21-31 em 18 mohms água, semelhante a um procedimento executado por Yang et al. Xiv
Ultraflat ouro substratos xv foram feitas. 40 mL da solução de um mês de idade (de incubação à temperatura ambiente, pH 5,5) foi depositada por vários minutos sobre substratos de ouro fresco ultraflat. Eles foram rapidamente lavados com um fluxo de água de 18 mohms, secas com fluxo de gás N 2 e posicionado no instrumento ANSIM.
A Figura 11 mostra topografia e de campo próximo imagens recolhidas para as fibrilas # 21-31 peptídeo. A) imagem Topografia obtidos simultaneamente com a sua imagem de campo próximo correspondente. Os rótulos representam fibrilas individuais e são utilizadas para caracterizar o tipo de conformação secundário cada fibrila tem. Correspondente B e C) de campo próximo imagens coletadas em dois números de onda diferentes: 1631 e 1691 cm -1. A área de cada imagem é de 1 x 1 mícron 2. Escala da esquerda representa a altura, escala da direita é o campo espalhado a partir do amplificador lock-in.
Figura 11 
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Acknowledgments
Agradecemos NSF, NSERC, NIH, e ONR.
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