Summary
Abstract
Hematopoietic स्टेम सेल HSC () pluripotent कोशिकाओं है कि एक जीव की जीवन भर सभी विभेदित रक्त प्रजातियों को बनाए रखने की एक दुर्लभ आबादी हैं. HSC के कार्यात्मक परिभाषा एक प्रतिरोपित सेल है कि एक विकिरणित प्राप्तकर्ता लंबी अवधि के सभी रक्त प्रजातियों पुनर्गठन करने की क्षमता है है. इस पदनाम स्तनधारी प्रणाली में मौलिक काम के दशकों द्वारा स्थापित किया गया था. Hematopoietic सेल प्रत्यारोपण (HCT) और माउस में रिवर्स आनुवंशिक जोड़तोड़ का प्रयोग, HSC जीव विज्ञान के अंतर्निहित नियामक कारकों को अनावरण किया शुरुआत कर रहे हैं, लेकिन अभी भी काफी हद तक के तहत पता लगाया. हाल ही में, zebrafish एक शक्तिशाली आनुवंशिक हड्डीवाला hematopoiesis अध्ययन के मॉडल के रूप में उभरा है. Zebrafish में HCT की स्थापना के वैज्ञानिकों ने बड़े पैमाने पर आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीनिंग zebrafish में उपलब्ध उपन्यास HSC विनियमन अंतर्निहित तंत्र प्रकट तरीके का उपयोग करने के लिए अनुमति देगा. इस अनुच्छेद में, हम एक वयस्क zebrafish में HCT प्रदर्शन विधि प्रदर्शित करता है. हम विच्छेदन और zebrafish पूरे गुर्दे मज्जा की तैयारी, zebrafish में वयस्क hematopoiesis की साइट, और intracardiac इंजेक्शन के माध्यम से विकिरणित प्राप्तकर्ता मछली के संचलन में इन दाता कोशिकाओं की शुरूआत दिखाते हैं. इसके अतिरिक्त, हम एक "आईसीयू" में मछली की देखभाल के बाद प्रत्यारोपण का वर्णन करने के लिए अपने दीर्घकालिक स्वास्थ्य में वृद्धि. सामान्य, मछली के कोमल देखभाल में पहले, दौरान और बाद प्रत्यारोपण के लिए मछली की संख्या है कि एक से अधिक महीने के लिए निम्न कार्यविधि का है, जो लंबी अवधि के मूल्यांकन (<3 महीने) engraftment लिए आवश्यक है बच जाएगा में वृद्धि करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रयोगात्मक इस प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया डेटा कहीं प्रकाशित किया जाएगा. इस प्रोटोकॉल की स्थापना बड़े पैमाने पर zebrafish आनुवंशिकी और प्रत्यारोपण के जीव विज्ञान के विलय के लिए अनुमति देगा.
Protocol
किरणन
- चमकाना प्रत्यारोपण से पहले 25Gy 2 दिन में WT मछली
गुर्दा विच्छेदन
- Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / मछली पानी की लीटर) (दाता मछली प्रति 500,000 कोशिकाओं का औसत) में फ्लोरोसेंट दाताओं की उपयुक्त संख्या का बलिदान
- 0.9X + 5% FCS ट्यूब पीबीएस + 1% strep पेन में पीबीएस ("+") में गुर्दे पृथक
- 1ml pipet के साथ तोड़, तो 18 1 / 2 जी सुई के साथ 10ml सिरिंज के साथ
- 50ml शंक्वाकार में स्थानांतरण और पीबीएस के साथ भरने +
- नीचे @ 8min 1500rpm स्पिन
- बाहर डालो, बड़ी मात्रा और 40micron फिल्टर के माध्यम से फिल्टर में resuspend गोली
- नीचे @ 8min 1500rpm स्पिन
- बाहर डालो, 1ml पीबीएस में resuspend + Eppendorf ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण
- गिनती करने के लिए: 10ul सेल प + 90ul trypan नीले (अब यह 10X पतला है)
- 10ul सेल प + 90ul पीबीएस + (अब यह पतला है 10X)
- 5 मिनट खड़े चलो, hemacytometer के दोनों ओर 10ul दोनों प जोड़ने
- बड़े (5x5) बॉक्स, खाते में मृत्यु प्रतिशत के लिए कोशिकाओं की गणना महत्वपूर्ण अगर
- / एमएल = (कोशिका गिनती) (4 10) (x10 दिल कारक.) कोशिकाओं
उदाहरण - 60 hemacytometer पर गिना कोशिकाओं कुल 6,000,000 कोशिकाओं है - नीचे स्पिन 1500rpm @ नमूना 8min
- Resuspend में गोली मात्रा गणना करने के लिए कक्षों की उचित एकाग्रता
- 3ul जा रहा WKM और 2ul जा रहा है परिधीय रक्त - 5ul कुल मात्रा इंजेक्षन
- उदाहरण - ६०००००० कोशिकाओं कुल
प्राप्तकर्ता प्रति 200.000 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए चाहते हैं
20 प्राप्तकर्ताओं है
66,667 कोशिकाओं / उल (२००००० कोशिकाओं / 3ul) करना चाहते हैं
90ul में resuspend गोली (६०००००० कोशिकाओं / 66,667 कोशिकाओं / उल)
केवल उस के बारे में 60ul की जरूरत है (20recip एक्स 3ul)
परिधीय रक्त निष्कर्षण
- वाहक रक्त (दाता प्रति 2,000,000 कोशिकाओं के औसत) के लिए tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / मछली पानी की लीटर) में WT मछली की उपयुक्त संख्या बलिदान
- Anticoagulant: 1ml पीबीएस में पतला 1ul (3unit/ul) +
- कोट हेपरिन के साथ pipet टिप, गिल के माध्यम से pipet टिप के साथ चाकू, पीबीएस के लिए रक्त जोड़ने +
- 1500rpm 5min, 1.5mL में resuspend स्पिन
- 1500rpm 5min, 1ml में resuspend स्पिन
- 40micron फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर
- ऊपर के रूप में कोशिकाओं की गणना
- / एमएल = (कोशिका गिनती) (4 10) (x10 दिल कारक.) कोशिकाओं
- खाता मौत के लिए
- Resuspension मात्रा की गणना ऊपर के रूप में
इंजेक्शन
- एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर प्रत्येक प्राप्तकर्ता के दिल में 5ul इंजेक्षन
- नम स्पंज पर tricaine में मछली (4.2ml (4mg/ml) मछली / Tricaine 100ml पानी) और जगह anesthetize
- दिल के पीछे एक छोटी सी टिप सम्मिलित
- दिल के आसपास के क्षेत्र प्रहार जब तक आप खून की एक छोटी फट (जिसका अर्थ है आप दिल मारा) देखते हैं -> यह नहीं देख सकते हैं लेकिन वैसे भी इंजेक्षन शायद
मछली आईसीयू के बाद इंजेक्शन
- 1 सप्ताह के लिए प्रवाह बंद मछली रखने के लिए संक्रमण से बचने
- पिंजरे प्रति 5-10 मछली रखो
- मृत निकालें और रिकॉर्ड रखना
- मैन्युअल रूप से प्रत्येक दिन पानी बदल
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