Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Summary

Abstract

Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) sind eine seltene Population von pluripotenten Zellen, die alle differenzierten Blut-Linien während der gesamten Lebensdauer eines Organismus aufrecht zu erhalten. Die funktionale Definition eines HSC ist eine transplantierte Zelle, die die Fähigkeit zur Wiederherstellung all das Blut Linien eines bestrahlten Empfänger langfristig hat. Diese Bezeichnung wurde von Jahrzehnten der bahnbrechenden Arbeit in Säugetier-Systemen etabliert. Mit hämatopoetische Stammzelltransplantation (HCT) und genetische Manipulationen in der Maus, sind die zugrunde liegenden regulatorischen Faktoren von HSC Biologie Anfang an vorgestellt werden, sind aber immer noch weitgehend unter-erforscht. Vor kurzem hat der Zebrafisch als leistungsfähige genetische Modell, Wirbeltier Hämatopoese Studie hervor. Gründung HCT in Zebrafisch wird den Wissenschaftlern ermöglichen, die groß angelegte genetische und chemische Screening-Methoden zur Verfügung im Zebrafisch neuartige Mechanismen HSC Regelung offenbaren nutzen zu können. In diesem Artikel zeigen wir eine Methode, um HCT bei erwachsenen Zebrafisch durchführen. Wir zeigen die Zerlegung und Aufbereitung von Zebrafisch gesamte Niere Knochenmark, dem Ort der Blutbildung Erwachsenen in der Zebrafisch, und die Einführung dieser Spenderzellen in den Kreislauf von bestrahlten Empfänger Fisch über intrakardiale Injektion. Zusätzlich beschreiben wir die nach der Transplantation Pflege von Fischen in einem "ICU", um ihre langfristige Gesundheit zu erhöhen. Im Allgemeinen sanfte Pflege der Fische vor, während und nach der Transplantation ist entscheidend für die Anzahl der Fische, die mehr als einen Monat nach dem Verfahren, die wesentlich für die Beurteilung der langfristigen (<3 Monate) Transplantation ist überleben wird zunehmen. Die experimentellen Daten verwendet, um dieses Protokoll zu etablieren wird an anderer Stelle veröffentlicht werden. Die Einrichtung dieses Protokoll wird für die Fusion der großen Zebrafisch Genetik und Biologie Transplantation zu ermöglichen.

Protocol

Bestrahlung

1. Bestrahlen WT Fisch 25Gy 2 Tage vor der Transplantation

Kidney Dissektion

1. Sacrifice entsprechende Anzahl von fluoreszierenden Spender in Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / Liter Fisch Wasser) (Durchschnitt von 500.000 Zellen pro Spender Fisch)
2. Isolieren Niere in 0.9X PBS + 5% FCS + 1% Penn Strep ("PBS +") in Rohr
3. Break up mit 1ml Pipette, dann mit 10ml Spritze mit 18 1 / 2 G-Nadel
4. Transfer in 50 mL konische und füllen sich mit PBS +
5. Spin down @ 1500rpm 8min
6. Gieße, Pellet erneut in großem Volumen und Filter, durch 40micron Filter
7. Spin down @ 1500rpm 8min
8. Gieße, resuspendieren in 1ml PBS +, um Eppendorf-Röhrchen übertragen
9. Zum Zählen: 10ul Zelle Sol + 90ul Trypanblau (jetzt ist es verdünnt 10X)
10. 10ul Zelle Sol + 90ul PBS + (jetzt ist es verdünnt 10X)
11. Stehen lassen, 5 min, fügen Sie 10ul sowohl Sol zu beiden Seiten der Hämazytometer
12. Zählen von Zellen in großen Kasten (5x5), wegen des Todes Prozentsatz, wenn wesentliche
13. Zellen / ml = (Zellzahl) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Factor)
    
    Beispiel - 60 Zellen auf Hämazytometer gezählt wird 6.000.000 Zellen insgesamt
    
    
14. Abzentrifugieren @ 1500rpm 8min
15. Berechnen Sie Volumen Pellet erneut in eine angemessene Konzentration von Zellen erhalten
16. 5UL Gesamtvolumen zu injizieren - 3UL wird WKM und 2UL zu peripheren Blut
17. Beispiel - haben 6.000.000 Zellen insgesamt
    
    wollen 200.000 Zellen pro Empfänger Transplantation
    
    haben 20 Empfänger
    
    wollen 66.667 Zellen / ul (200.000 Zellen / 3UL)
    
    Pellet in 90ul (6.000.000 Zellen / 66.667 Zellen / ul)
    
    Sie benötigen nur rund 60ul dieser (20recip x 3UL)

Periphere Blut-Extraktion

1. Sacrifice entsprechende Anzahl von WT Fisch in Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / Liter Fisch Wasser) für Carrier-Blut (durchschnittlich von 2.000.000 Zellen pro Spender)
2. Gerinnungshemmer: verdünnen 1UL (3unit/ul) in 1 ml PBS +
3. Coat Pipettenspitze mit Heparin, stab durch Kiemen mit Pipettenspitze, fügen Blut PBS +
4. Spin 1500rpm 5min, in 1,5 ml resuspendieren
5. Spin 1500rpm 5min, in 1 ml resuspendieren
6. Filter durch 40micron Filter
7. Zählen von Zellen, wie oben
8. Zellen / ml = (Zellzahl) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Factor)
9. Konto für den Tod
10. Berechnen Resuspension Volumen wie oben

Injektion

1. Inject 5UL in Herz eines jeden Empfänger mit einer Hamilton-Spritze
2. Anesthetize Fisch in Tricaine (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100ml Fisch Wasser) und am feuchten Schwamm
3. Die Spitze ein wenig hinter Herzen
4. Stöbern Sie in der Herzgegend, bis Sie einen kleinen Ausbruch von Blut (das heißt, Sie treffen das Herz) zu sehen -> Might nicht sehen, aber trotzdem spritzen

Fisch ICU - nach der Injektion

1. Keep Fisch off flow für 1 Woche um Infektionen zu vermeiden
2. Gib 5-10 Fische pro Käfig
3. Entfernen Sie leere und Erfassung
4. Ändern Sie manuell Wasser pro Tag