Summary
Abstract
Hematopoetiska stamceller (HSC) är en sällsynt population av pluripotenta celler som underhålla alla de differentierade blodet linjerna under hela livet i en organism. Den funktionella definitionen av en HSC är ett transplanterat celler som har förmågan att rekonstruera allt blodet linjerna av en bestrålad mottagare lång sikt. Denna beteckning grundades av decennier av banbrytande arbete i däggdjur system. Använda hematopoietisk cell transplantation (HCT) och omvänd genetiska manipulationer i musen, är de bakomliggande reglerande faktorer av HSC biologi börjar bli avslöjade, men är fortfarande till stor del underprospekterat. Nyligen har zebrafisk visat sig vara en kraftfull genetisk modell för att studera ryggradsdjur blodbildningen. Etablera HCT i zebrafisk kommer att tillåta forskare att utnyttja storskaliga genetiska och kemisk screening metoder tillgängliga i zebrafisk att avslöja nya mekanismerna bakom HSC reglering. I den här artikeln visar vi en metod för att utföra HCT hos vuxna zebrafisk. Vi visar dissekering och beredning av zebrafisk hela njure märg, platsen för vuxna blodbildningen i zebrafisk, och införandet av dessa givare celler i cirkulationen av bestrålade mottagarens fisk via intrakardiell injektion. Dessutom beskriver vi efter transplantation vård av fisk i en "IVA" för att öka deras långsiktiga hälsa. I allmänhet milda hand om fisken innan, under och efter transplantationen är avgörande för att öka antalet fiskar som överlever mer än en månad efter den procedur, som är väsentlig för bedömning av de långsiktiga (<3 månader) engraftment. Den experimentella data används för att upprätta detta protokoll kommer att publiceras någon annanstans. Inrättandet av detta protokoll kommer att möjliggöra en sammanslagning av storskaliga zebrafisk genetik och transplantation biologi.
Protocol
Bestrålning
- Bestråla WT fisk vid 25Gy 2 dagar före transplantation
Njure dissektion
- Offer lämpligt antal fluorescerande givare i tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / liter fisk vatten) (genomsnitt på 500.000 celler per donator fisk)
- Isolera njure till 0.9x PBS + 5% FCS + 1% Penn STREP ("PBS +") i röret
- Bryt upp med 1 ml pipett, sedan med 10 ml spruta med 18 1 / 2 G nål
- Överföring till 50mL koniska och fyll upp med PBS +
- Spinn ner @ 1500rpm 8min
- Häll ut återsuspendera pelleten i stora volymer och filtrera genom 40micron filter
- Spinn ner @ 1500rpm 8min
- Häll ut återsuspendera i 1 ml PBS +, överföring till Eppendorf-rör
- Att räkna: 10ul cell sol + 90ul trypan blå (nu är det späds ut 10X)
- 10ul cell sol + 90ul PBS + (nu är det utspätt 10X)
- Låt stå 5 min, lägg 10ul både sol till endera sidan av hemacytometer
- Räkna celler i stor låda (5x5), står för döden procent om betydande
- Celler / ml = (celler) (10 4) (x10 DIL. Faktor)
Exempel - 60 celler räknas på hemacytometer är 6.000.000 celler totalt - Spinn ner prov @ 1500rpm 8min
- Beräkna volym för att resuspendera pelleten i för att få lämplig koncentration av celler
- 5ul totala volymen att injicera - 3ul vara WKM och 2ul vara perifert blod
- Exempel - har 6.000.000 celler totalt
vill att transplantera 200.000 celler per mottagare
har 20 mottagare
vill ha 66.667 celler / ul (200.000 celler / 3ul)
Resuspendera pelleten i 90ul (6 miljoner celler / 66.667 celler / UL)
bara behöver ungefär 60ul av att (20recip x 3ul)
Perifert blod utvinning
- Offer lämpligt antal WT fisk i tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / liter fisk vatten) för bärare blod (i genomsnitt 2.000.000 celler per donator)
- Antikoagulantia: Späd 1ul (3unit/ul) i 1 mL PBS +
- Coat pipettspetsen med heparin, hugg genom gäl med pipettspetsen, lägga blod till PBS +
- Spin 1500rpm 5min, återsuspendera i 1,5 mL
- Spin 1500rpm 5min, återsuspendera i 1 mL
- Filtrera genom 40micron filter
- Räkna celler som ovan
- Celler / ml = (celler) (10 4) (x10 DIL. Faktor)
- Konto för dödsfall
- Beräkna resuspension volym som ovan
Injektion
- Injicera 5ul in i hjärtat av varje mottagare med hjälp av en Hamilton spruta
- Bedöva fisk i tricaine (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100 ml fisk vatten) och lägg på fuktig svamp
- Sätt spetsen lite efter hjärtat
- Peta runt hjärtat område tills du ser en liten explosion av blod (vilket innebär att du trycker på hjärtat) -> kanske inte ser detta, men injicerar ändå
Fisk ICU - efter injektion
- Håll fiska utanför flödet under 1 vecka för att undvika infektion
- Sätt 5-10 fiskar per bur
- Ta bort döda och föra register
- Manuellt byta vatten varje dag
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
