Biology

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/159

Jocelyn LeBlanc¹, Teresa Venezia Bowman¹, Leonard Zon¹

¹Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Abstract

Células-tronco hematopoiéticas (HSC) são uma população rara de células pluripotentes que mantêm todas as linhagens de sangue diferenciada ao longo da vida de um organismo. A definição funcional de um HSC é uma célula transplantada que tem a capacidade de reconstituir todas as linhagens de sangue de um termo destinatário irradiados longo. Esta designação foi estabelecida por décadas de trabalho seminal em mamíferos. Utilizando transplante de células hematopoiéticas (TCH) e reverter manipulações genéticas no mouse, os factores subjacentes reguladoras da biologia HSC estão começando a ser revelada, mas ainda são largamente sub-exploradas. Recentemente, o peixe-zebra emergiu como um poderoso modelo genético para estudo hematopoiese vertebrados. Estabelecer HCT em zebrafish permitirá que os cientistas utilizam em grande escala metodologias de triagem genética e química disponível em zebrafish para revelar novos mecanismos subjacentes ao Regulamento HSC. Neste artigo, vamos demonstrar um método para executar HCT em peixe-zebra adulto. Nós mostramos a dissecação e preparação de medula renal zebrafish todo, o local de hematopoiese adulto no peixe-zebra, e com a introdução dessas células de doadores para a circulação de peixes destinatário irradiado via injeção intracardíaca. Além disso, descrevemos os cuidados pós-transplante de peixes em uma "UTI" para aumentar a sua saúde a longo prazo. No atendimento, em geral suave do peixe antes, durante e após o transplante é fundamental para aumentar o número de peixes que vão sobreviver mais de um mês após o procedimento, que é essencial para a avaliação de longo prazo (<3 meses) o enxerto. Os dados experimentais utilizados para estabelecer este protocolo será publicado em outro lugar. O estabelecimento deste protocolo vai permitir a fusão da genética em larga escala zebrafish e biologia transplante.

Protocol

Irradiação

Peixes irradiar WT em 25Gy dois dias antes do transplante

Dissecção renal

Sacrifício número adequado de doadores fluorescentes em tricaina (~ 100ml 4mg/ml tricaina / litro de água de peixe) (média de 500.000 células por peixe doador)
Isolar rim em 0.9x PBS + 5% FCS tubo + 1% strep Penn ("PBS +") em
Romper com pipeta de 1ml, em seguida, com seringa de 10 ml com 18 1 / 2 agulha G
Transferência para 50mL cônica e encher com PBS +
Spin down @ 1500rpm 8min
Derramarei, ressuspender pellet em grande volume e filtrar através de filtro 40micron
Spin down @ 1500rpm 8min
Derramarei, ressuspender em 1 ml de PBS +, transferir para tubo eppendorf
Para contar: 10ul célula sol + 90ul azul de tripano (agora ele é diluído 10X)
10ul célula sol + 90ul PBS + (agora ele é diluído 10X)
Deixe repousar 5 min, adicionar 10ul tanto sol para os lados de hemocitômetro
Contagem de células em caixa grande (5x5), respondem por porcentagem significativa de morte se
Células / ml = (contagem de células) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Fator)

Exemplo - 60 células contadas em hemocitômetro é de 6.000.000 total de células
Spin down amostra @ 1500rpm 8min
Calcular o volume para ressuspender sedimento em obter concentração adequada de células
Volume total 5ul para injetar - WKM sendo 3ul e sangue periférico sendo 2ul
Exemplo - 6.000.000 total de células

quero transplante de 200.000 células por beneficiário

ter 20 destinatários

quero 66.667 células / ul (200.000 células / 3ul)

ressuspender sedimento em 90ul (6.000.000 células / 66.667 células / ul)

só precisa de cerca de 60ul que (x 20recip 3ul)

Extração de sangue periférico

Sacrifício número apropriado de peixes no WT tricaina (~ 100ml 4mg/ml tricaina / litro de água de peixe) para o sangue transportador (média de 2.000.000 células por doador)
Anticoagulante: 1ul diluído (3unit/ul) em 1mL de PBS +
Ponta da pipeta revestimento com heparina, por meio de emalhar com facada ponta da pipeta, adicione sangue para PBS +
Girar 1500rpm 5min, ressuspender em 1,5 ml
Girar 1500rpm 5min, ressuspender em 1 ml
Filtrar através de filtro 40micron
Contagem de células como acima
Células / ml = (contagem de células) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Fator)
Conta para a morte
Calcular o volume de ressuspensão como acima

Injeção

5ul injetar no coração de cada destinatário usando uma seringa de Hamilton
Anestesiar peixes em tricaina (4.2ml (4mg/ml) peixes de água tricaina / 100ml) e coloque na esponja úmida
Introduza a ponta um pouco atrás do coração
Bisbilhotar área do coração até ver uma pequena explosão de sangue (o que significa que atingiu o coração) -> não pode ver isso, mas mesmo assim injetar

UTI peixe - pós-injeção