Summary
Эта работа описывает основные процедуры неинвазивных маленькое животное МРТ и МРС
Abstract
Малый животных магнитного резонанса (МР) исследования стала важным элементом современных биомедицинских исследований из-за его неинвазивной природы и богатство биологической информации, которую он обеспечивает. MR не требует никаких ионизирующего излучения и может неинвазивно обеспечивают более высокое разрешение и лучше сигнал-шум по сравнению с другими томографического или спектроскопических методов. В этом протоколе, мы сосредоточим внимание на мелких животных МРТ и МР-спектроскопия (МРТ / МРС) для неинвазивного приобрести релаксации взвешенный
Protocol
Часть 1: Магнит безопасности
Оба МРТ и МРС использовании сильного магнитного поля, что требует крайней осторожности. Например, 4,7 Т инструмент, который мы использовали для настоящей работы имеет магнитное поле примерно в 90000 раз магнитного поля Земли. Сильное магнитное поле всегда, даже когда сканер MR не используется. Любой металлический предмет, который вступает в контакт с таким сильным магнитным полем будет сильно и быстро привлекают магнита. Это очень опасно, если испытуемый или оператора находится в пути снаряда металлический предмет, летя в магнит. Таким образом, сотрудники, которые проводят MR экспериментов должны быть осторожны, чтобы удалить любые металлические предметы одежды перед входом близость прибора, а также сохранить окружающую среду, свободную от таких объектов. Более подробную информацию о магнит безопасности появляется в литературе 1 и следующие веб-страницы: http://www.imrser.org/ . Наличие металлического материала может не только вызвать выше проблем безопасности, но вмешиваться в экспериментальных результатов, вызывая изображения / спектроскопических артефактов. Металлические представить материал вблизи или внутри изображения объекта может изменить магнитное поле в окрестности и так генерировать артефакты на полученные изображения или расширить ширину линии спектров.
Соответственно, оставить бумажник, ключи, ручки и т.д. вне магнита, если Вы обращаетесь с животными для процедур, MR.
Часть 2: В Vivo МРТ Мышь в горизонтальное отверстие Магнит
Животное Подготовка к МРТ
- Все процедуры животное должно быть одобрено институционального ухода за животными и использовать комитета (IACUC) до выполнения любых видов животных обработки.
- Мы используем испаряется изофлуран для обезболивания животных для МРТ эксперименты. Анестезия животных может быть достигнуто за счет других анестетиков, таких как авэртин (2,2,2-tribromoethanol или КЭ) и коктейль из кетамина и ксилазина. Дозировка информация каждого анестетика находится в таблице 1.
- Линии индукции камеры с пластиковыми поддержал абсорбирующей прокладки (синие панели или патрон). Место мыши (или нескольких мышей в течение нескольких изображений мыши) в индукции камеры.
- Отрегулируйте расходомер изофлуран испаритель до 0,8 1,5 л / мин. Затем настройте изофлуран испаритель до 4% в течение 2 3 минут.
- После достижения хирургического наркоза плоскости (то есть без ответа носок щепотку), навести мышь на животных держатель с носом вставляется в носовой конус (или маска). Голову фиксатор может быть использована для обработки изображений и глава тела держатель может использоваться для визуализации тела.
- Животное держатели используются для предотвращения потенциального движения: Есть несколько типов коммерческих владельцев. Кроме того, специально созданных держателя могут быть изготовлены для размещения любых особых требований экспериментальной установки. Для специально созданных держатель, убедитесь, что используются только немагнитных материалов.
- Во время визуализации период, настроить расходомер на 0,4 0,8 мл / мин и снизить изофлуран испаритель на 1,2 1,5%. Истек газа, поступающего из конуса носа мыши собирается насосом и удаляется в внутреннего вакуума.
- Глаза животного будет влажной стерильной мази смазочных глаза. Животное будет храниться при температуре 35-37 ° С в течение эксперимента в теплой система циркуляции воды. Другие типы источников тепла могут быть использованы такие, как нагревается колодки и теплый воздух выдувается в радиочастотной (РЧ) катушки.
- Система мониторинга животного для мониторинга температуры тела, дыхания / сердечного цикла, и синхронизировать дыхание / сердечной стробирования с изображением приобретений.
- Стандартный образец изготовлен из агарозы находится рядом с животным следить резкое изменение сигнала. Это стандартный образец агар особенно полезно для мульти-ломтик и мульти-временной точке изображения. Когда неожиданное изменение обнаружен сигнал в часть из полученных изображений, срез с неожиданным изменением сигнала могут быть устранены. Кроме того, его интенсивность сигнала может быть настроен на основе изменения сигнала стандартного образца в процессе пост-анализа изображений.
- После надежно размещения животных и мониторинга компонентов на животных держатель, положение животного владельцу в центре РФ катушку.
- Перемещение РФ катушки к магниту комнату и вставьте катушку РФ в теплую системы циркуляции воды помещается внутри магнита. На рисунке 2 показаны некоторые компоненты магнитно-резонансной томографии наблюдали из передней части отверстие магнита.
МРТ Эксперимент
- Tune РФ катушку 1 резонансной частоты H и соответствуют волновым сопротивлением катушки 50 Ом использованием настройки панели сканера MR. Это необходимо для достижения оптимальных условий приема сигнала. Большинство человеческих МРТ сканеры не требуют отдельного процесса настройки / матч за исключениемВ MRS процедур.
- Поведение прокладок процесс с использованием одной последовательности импульсов. Сигнал MR опирается на экологические магнитного однородность поля. Шиммирования процесс позволяет магнитного поля в области, представляющие интерес для столь однородна, как это возможно. Каждый сканер MR имеет свой собственный способ выполнить шиммирования процесса, в том числе автоматическое быстро шиммирования процессов, таких как быстрый карте и градиент прокладок.
- Оптимизация РЧ импульс за счет максимального одномерного изображения профиля. Радиоимпульс полномочия могут быть выстроены, сохраняя при этом длительность импульса постоянной и достаточно долго, TR (переработке задержки), что составляет примерно 3 - 5 раз T 1 тканей.
- Приобретать разведчик изображения вдоль трех ортогональных ориентаций создать осевые, корональной и сагиттальной изображений. Быстрой последовательности захвата изображений (т.е. эхо градиент или быстро спиновое эхо отображающей последовательности) могут быть использованы для приобретения разведчик изображений. Полученные изображения будут использованы для планирования фактические изображения с определением изображений самолетов.
- Изменение спиновое эхо последовательность. Выберите соответствующие параметры последовательности: TR (переработке задержки) должны быть три-пять раз ткани T 1 приобретать полностью расслабленным изображений, таких как плотность протонов или T 2 взвешенных изображениях. TE (эхо времени) длительности между первым импульсом РФ и центра эхо-сигнала. Значение TE может быть выбран в зависимости от контраста изображения как показано в таблице 2. На рисунке 2 показан в естественных изображений, полученных с различными эффектами релаксации T 1, T 2 и T 2 * для мыши с обнаженной ксенотрансплантата опухоли на спине.
- T 2 измерений может быть сделано либо с помощью multiecho изображений или отдельных изображений эхо с несколькими значениями TE.
- После МРТ / МРС в естественных условиях эксперимента, животные должны быть проверены по всему процессу восстановления. После МРТ, животные будут выведены из РФ катушку и мониторинг для обеспечения полного восстановления, когда вернулся в клетку. Потери тепла происходит быстро под наркозом мышей. Держите животных теплой, покрывая их марлей подушки или полотенца и / или предоставление источника тепла, пока животные оправилась от наркоза.
Обработка изображений
- Обзор полученных изображений на консоли МР и передачи выбранных данных на пост-обработки компьютером.
- Обычно мы используем ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) для анализа изображений. Анализа изображений включает в себя масштабирование изображения / фильтрации, расчеты T 1, T 2 и диффузию, опухоль измерения объема и сегментации опухолей.
Часть 3. В Vivo MRS для мыши задних конечностей скелетной мышце в вертикальные отверстия магнита
Строительство манжеты для стимулирования Реверсивные ишемии
- Начать с куском трубы ПВХ, что составляет примерно 5-7 мм с внутренним диаметром 12-15 мм. Просверлить маленькое отверстие в стене этой части и нити.
- Сократите часть воздушного шара, так что открытым на обоих концах (воздушные шарики гелием качество работы лучше всего). Вставьте этот кусок через кусок ПВХ и оберните вокруг спины и ленты концы на внешней стене кусок ПВХ.
- Используйте термоусадочная пленка для уплотнения шара концов вокруг трубы. Вы должны иметь манжеты с твердой внешней стены и надувные внутренней стенке.
- Вырежьте области термоусадочная пленка и воздушный шар вокруг отверстие с резьбой, заботясь, чтобы оставить достаточно материала между отверстием и краем кусок ПВХ. Тема 1.5 см кусок цветного металла (например, латунь) в отверстие в ПВХ. Это позволяет надувать манжету. Печать области с 5 минут эпоксидной смолы.
- Устранить манжеты на место рядом с катушкой РФ в зонд MRS и подключения к внешним сфигмоманометра.
Custom Монитор дыхания
- Мы используем индивидуальный заказ дыхание монитор, который сделан для совместимости с ограниченным пространством и доступом к отверстие магнита. Некоторые коммерческие модели также доступны.
- Tie баллончик до конца растянуть стойких труб подается в зонд.
- Присоединить другой конец трубки с датчиком давления.
- Убедитесь, что линии и воздушный шар не содержит пузырьков воздуха. Пузырьки будут ослаблять сигнал от сжатия воздушного шара, вызванное движением мыши тела из-за дыхания.
Мышь Позиционирование в MRS зонда
- Обезболить мышь с 5% Avertin (0,010 мл / г массы тела).
- После достижения хирургического наркоза плоскости, положение мыши в MRS зонд путем размещения мыши на спине на поддержку мыши. Место заполненные жидкостью баллон на брюшной стороне мыши и в безопасности в месте с ремнями поддержку мыши.
- Мыши Положение и тела поддержку в зонд MRS.
- Вытяните один задних конечностей через ишемический манжеты и MRS катушку. Нога должна быть сосредоточена в катушке, как муч, насколько возможно. Такое расположение позволяет корпусе мыши должен быть расположен горизонтально в вертикальных отверстие магнита (рис. 3).
- Fix ноги на месте с помощью записи на пленку ноги на жесткой опоре.
- Место термопары подкожно в задних конечностей за пределами региона, отобранных катушку.
- Смочите глаза глазная мазь, чтобы предотвратить смазывание глаз от высыхания. Обложка мыши глаза и лицо, чтобы предотвратить натирание или раздражение от стенки зонда.
- Другие датчики мониторинга могут быть добавлены в зависимости от конкретных потребностей эксперимента.
Настройка MRS Эксперимент
- Подключите воздушный поток для нагревательного элемента на зонде MRS.
- Установите переменную блок управления температурой на программное обеспечение VNMR поддерживать ногу температура 35-37 ° С.
- Настройка частоты катушки и согласование сопротивлений использованием настройки панели в программном обеспечении MRS для 1 Н и 31 Р резонансов.
- Отрегулируйте шиммирования схем оптимизации однородности B1 магнитного поля в области интереса с использованием 1 Н спектроскопии.
- Переключить на 31 Р-частота для определения ширины импульса РФ, чтобы получить максимальное сигнал от одного спада свободной индукции (FID) (90 ° времени).
- Сбор высокий сигнал-шум полностью расслабленным спектры (ФРС), чтобы определить соотношение неорганического фосфата (P я) и фосфокреатина (ПЦР) в СПС при полностью расслабленной условиях. Эти спектры получены с помощью 90 ° время от времени между приобретениями FID (TR) примерно в 5 раз T 1 ПЦР (20 сек. В 7 т). Они будут использоваться для количественного определения ПЦР и P уровней я у г-спектров.
Ишемическая Эксперимент
- Простой ишемической возмущений позволяет для определения максимального отдыха и митохондриальной производства АТФ измерения изменений в фосфокреатина во время и сразу после ишемии.
- Настройка массива собрать несколько спектров с использованием 45 ° ширины импульса (то есть 0,5 х 90 °, время) и TR в 0.5x T 1 (~ 1,5 сек.). Как правило, мы собираем 4 FIDS для каждого спектра (число усреднений (па) = 4 в VNMR программное обеспечение) для временного разрешения около 6 секунд. На этот раз разрешение достаточно точно определить отдыха и максимального производства митохондриальной АТФ.
- Сбор отдыха спектров в течение примерно 5 минут.
- Вызвать ишемии, раздувая манжеты на 270-300 мм рт.ст. в течение 10-12 минут.
- Выпуск манжеты и собирать восстановления спектров в течение 5 минут.
- Удаление зонда от магнита и мышь от зонда. Разрешить мыши, чтобы оправиться от наркоза при соответствующих условиях. Эксперименты могут повторяться в последующие дни. После окончательного спектроскопии эксперимента мышцы мыши нога удаляются и немедленно заморозить, зажатый в жидком N 2 для анализа концентрации АТФ с помощью ВЭЖХ.
Анализ данных
- Данные проанализированы сообщения с помощью одного из нескольких спектральных программ для анализа спектров ЯМР. Наша лаборатория обычно использует подходят к стандартным 2 и jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) для количественного площадей пиков.
- Первоначальная разбивка PCr ставки при ишемии являются мерой митохондриальной производства АТФ под гипоксическим условиям, как это описано в ряде работ 3-5. PCr восстановления ставки могут быть использованы для определения максимальной мощности для производства митохондриальной АТФ на основе подхода, описанного ранее 4,6.
Рисунок 1. В естественных условиях МРТ установки осмотре перед отверстие магнита. Установка состоит из РФ катушки, система животного потеплении (или теплый системы циркуляции воды) и градиент вставки. Все эти компоненты вставляются в горизонтальной магните. Теплая вода нагревается в водохранилище за пределами магнита комнату и внедрены в системе потепления животных через трубку Tygon (зеленая лента). После циркулирующих в цилиндре, вода берется из потепление систему обратно в водохранилище будет нагреваться. Изофлуран трубы и вакуумной трубки используются для обезболивания мышей во время МРТ эксперименты.
Рисунок 2 В естественных изображений для мыши с обнаженной ксенотрансплантата опухоли (D282 опухоль) на спине (стрелка) с различными эффектами релаксации. A. T 1 весил изображения (TR / TE = 500/14.2ms). Б. T 2 весил изображения (TR / TE = 2s/40ms). Оба Т 1 и Т 2 взвешенных изображениях были приобретены спина последовательности эхо. С. Т 2 карты обрабатываются с 4 комплекта изображений, полученных с DIFразличными значениями TE от 20 до 80 мс. Д. T 2 * весил изображения (TR / TE = 180/7.39ms, флип угол = 20 градусов), приобретенных градиент последовательности эхо. Поле зрения 35 х 35 мм 2, для всех изображений MR.
Рисунок 3. Иллюстрация мышь позиционируется в горизонтальном держателе тела с ноги закреплены в РФ катушку.
Рисунок 4. В естественных условиях 31 Р-спектров через один цикл реперфузия ишемии. Данные были собраны на 7 Т вертикальные отверстия магнита и линии расширили с 20 Гц экспоненциальный фильтр. TR = 1, па = 4, каждые 20 спектры построены.
Таблица 1. Дозировка анестетик для мыши МРТ / MRS.
Животное Вид | Обезболивающий Агент | Доза (Мг / кг для инъекций) | Маршрут |
Мышь | Изофлюрана газа | 4,0% в течение 2-3 мин (индукция), то от 1,2 до 1,5% в непрерывном режиме (техническое обслуживание) | Ингаляционные через носовой конус |
Мышь | Avertin | 5%, 10ml/kg массы тела | внутрибрюшинно (IP) |
Мышь | Кетамин / Ксилазин | 100 мг / кг и 10 мг / кг | IP |
Таблица 2. Изображение с релаксацией веса
Изображение взвешивания | TR (переработке задержки) | TE (эхо времени) |
T1 | Короткий (короче T1) | Короткий (короче Т2) |
T2 | Длинные (3 ~ 5 раз T1) | Длинный (около Т2) |
PD (плотность протонов) | Длинные (3 ~ 5 раз T1) | Короткий (короче Т2) |
T1: спин решеточной релаксации (или продольная релаксация) время
T2: спин спиновой релаксации (или поперечной релаксации) время
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
До приобретения шаги настройки / матч и прокладок имеют решающее значение для приобретения высоким пространственным разрешением и высоким отношением сигнал-шум (SNR). Важно также следить животное условиях с системой мониторинга животного для поддержания стабильной физиологического состояния животных во время сигнала поглощения соблюдать гуманные обработки животных и предотвратить любые потенциальные искусственной измерений. Процедуры описаны в протоколе могут быть изменены, чтобы приобрести дополнительную информацию, в том числе диффузии, перфузии и поток изображений и локализованных спектроскопия в естественных условиях. Все препараты животного должны быть похожи, если процедура требует дополнительных настроек. Протоколы МРТ и МРС, описанных в данном исследовании были использованы для нескольких приложений, включая продольной МРТ исследования для развития нанозонды целевому опухолей 7 и MRS исследования по митохондриальной АТФ 5,8. МРТ и МРС полезны методы неинвазивно визуализировать анатомические животных, релаксация изменить или неразрушающего мониторинга обмена веществ. Оба метода могут быть использованы в качестве продольной процедуры мониторинга для изучения указанных изменений с течением времени. Для MRS мы создали пользовательский зонд РФ, который позволяет животному будет поддерживаться в горизонтальном положении в вертикальных отверстия магнита. Таким образом, эти эксперименты могут быть выполнены на любой вертикальной широким отверстием магнит, такие как это имеет место в большинстве департаментов химии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано частично NIH / NIBIB R21EB008166 для DL и НИА AG028455 и НИА AG022385 для DJM. Мы благодарим д-р Джеймс Олсон на Фреда Хатчинсона онкологический научный центр для обеспечения их D282 опухоли мышей.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Inova 200 MR scanner/4.7 T | Varian Inc., Agilent | Used for mouse MRI | |
Inova 300 NMR spectrometer/7 T | Varian Inc., Agilent | Used for MRS of mouse skeletal muscle |
References
- Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art. Radiol Med. 112, 491-491 (2007).
- Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes. Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).
- Amara, C. E. Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics. Methods. 46, 312-312 (2008).
- Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle. J Physiol. 465, 203-203 (1993).
- Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).
- Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity. Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).
- Sun, C. In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes. Small. 4, 495-495 (2008).
- Marcinek, D. J. Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle. J Physiol. 569, 467-467 (2005).