Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

Summary

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para o isolamento e purificação de

Abstract

O

Protocol

Comentários gerais sobre classificação Bead Magnética de Neurônios Drosophila periférica (tempo total para a Conclusão do Protocolo: 2,5-3 horas)

Procedimentos de laboratório padrão para manter um ambiente limpo e livre de RNAse devem ser observados em todos os momentos para prevenir a degradação do RNA.

Quando a Drosophila cutícula larval é dissecada e colocada no buffer de células dissociação, os neurônios periféricos são uma das células último a destacar do cutícula. Nós exploramos esta propriedade e projetado este protocolo para remover a maior parte das células não-específicas da cutícula, como músculo e gordura antes de isolar os neurônios da.

Com a prática, o protocolo de toda pode ser concluída com êxito em aproximadamente 2,5 horas. A preparação de contas revestidas de anticorpo deve ser concluída antes do experimento começa.

1. Preparando esferas magnéticas para Células Encadernação:

Esta etapa deve ser concluída antes do início do experimento. As contas preparadas podem ser preparados e armazenados a 4 ° C até ser necessário.

1. Lavar 100 l de contas Dynabeads M-280 Estreptavidina revestido três vezes em PBS pela ressuspensão em 500 mL de PBS fresco e peletização-lo em um campo magnético forte a cada vez.
2. Finalmente voltar a suspender as contas diretamente em 100 ul de undiluted biotinilado anticorpo anti-mouse-CD8a rato (concentração de anticorpos é 100 mg / ml).
3. Incubar a mistura por 1 hora no gelo com vórtex leve ocasional para evitar sedimentação. [1 mL de Dynabeads M-280 pode ligar 0,05-0,10 mg de anticorpo biotinilado].
4. Lave a mistura do grânulo-anticorpo três vezes como descrito no passo 1.1 para remover o excesso de anticorpo. O esferas magnéticas são agora revestidas com anticorpos e pronto para ser usado. Armazenar a mistura do grânulo-anticorpos em 100 l de 1X PBS a 4 ° C até o uso.

2. Selecionar e lavar Larvas: (10-15 minutos)

1. Escolha 30-50 anos combinados larvas de terceiro estádio e colocá-los em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml com 1-1,2 ml de fosfato 1X Buffered Saline (PBS). (3-5 minutos)
2. Fechar o tubo e vortex-lo no ajuste máximo três vezes por 1 segundo cada.
3. Usando um fogo-polido pipeta Pasteur desprezar o sobrenadante completamente. Repita a lavagem (2.1) e vortex (2.2) passos 3-4 vezes até que o sobrenadante é visivelmente clara de todas as partículas de alimentos e detritos.
4. Brevemente repetir a lavagem com 1 ml de etanol 70% e desprezar o sobrenadante.
5. Lavar as larvas duas vezes com 1 ml de ddH2O e desprezar o sobrenadante.
6. Brevemente repetir a lavagem mais uma vez com 1 ml de RNase-AWAY e desprezar o sobrenadante.
7. Lavar as larvas três vezes em 1 ml de ddH2O para assegurar a remoção completa de RNase-AWAY.

3. Dissecção: (10-12 minutos)

1. 12/10 larvas lugar no centro de uma placa revestida 35 milímetros Sylgard Petri. Posicioná-los um pouco longe um do outro. [Passo Crítico: Descarte qualquer larvas que não parecem estar no estágio apropriado de desenvolvimento]
2. Cortado a ponta anterior das larvas usando um par de tesouras de dissecação muito bem para todas as larvas.
3. Usando um par de maçante Dumont No. 5 fórceps inverter as larvas de dentro para fora. Inserir uma pinça dentro da cutícula larval todo o caminho até o fim posterior. Aperte as pontas das pinças juntos para agarrar a extremidade posterior da cutícula (Figura 1a) (tente pressionar a cutícula para baixo na superfície Sylgard para tornar mais fácil). Usando o segundo par de fórceps, empurre a cutícula larval dentro para fora. [Passo Crítico: Tente praticar este método algumas vezes antes de tentar a experiência de isolamento de células. Tentar obter as larvas totalmente invertido, para garantir que todos os tecidos moles são expostos à solução para a dissociação fácil.]
4. Depois de dissecar as larvas 3-4, transferi-los imediatamente ao fresco, gelada PBS (colocar o tubo no gelo) em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml.
5. Repita os passos 3,1-3,4 até que todas as larvas necessários são recolhidos (30-40 larvas neste protocolo). [Passo Crítico:. Antecipar 10-20% de perda durante a dissecção e dissociação, e decidir em conformidade]

4. Remoção de vagamente aderente não-específicos de células: (2-3 minutos)

[Este passo ajuda a compensação de vagamente aderente não-específica tecidos, tais como corpos gordos e CNS.]

1. Pegue o tubo de microcentrífuga 1,6 ml contendo as cutículas invertida larval e substituir o sobrenadante, com cerca de 700-800 mL de doce gelada PBS.
2. Pulso vortex-o tubo de microcentrífuga 5 vezes (3 segundos por pulso) em plena velocidade.
3. Desprezar o sobrenadante e substituí-la por cerca de 700-800 mL fresco, gelada PBS.
4. Repita os passos 4.2 e 4.3 três vezes.
5. Resuspend as cutículas larval em 400 mL de fresco, gelada PBS

5. Dissociar o tecido em uma suspensão única célula: (18-20 minutos)

[Passo Crítico: Over-dissociação pode causar a perda do marcador de superfície celular, levando à produção de células pobres e viabilidade celular baixa. O tecido larval pode ser dissociada por qualquer dissociação mecânica (ultra-som, douncing), dissociação enzimática (tripsina, colagenase, etc) ou uma combinação de ambos. Como estes tecidos larval são difíceis de dissociar, descobrimos que uma combinação de ambos dissociação mecânica e enzimática rendeu os melhores resultados.]

1. Adicione 1,5 mL de Liberase 1X Blendzyme 3 (28 unidades nsch W / frasco) para a cutícula larval suspensos em 400 mL de PBS.
2. Vortex a solução 2-3 vezes para cada um segundo a configuração máxima (Isto deve remover as células frouxamente aderente da cutícula na solução).
3. Incubar a solução à temperatura ambiente (22-25 ° C) por 5 minutos. [Passo Crítico: O tempo de incubação afeta grandemente a eficiência de classificação final, celular. O tempo de incubação recomendado deve ser suficiente para soltar o tecido. Não exceder 15 minutos.]
4. Pulso vortex-tubo 20-30 vezes em configurações máximas de 2 segundos por pulso em plena velocidade. Isto deve libera o músculo e outros tecidos para a solução. Inspecionar uma pequena amostra da solução em uma fluorescente estereomicroscópio em cada etapa. (Com a experiência deve ser capaz de determinar o nível de dissociação, observando o tubo de microcentrífuga diretamente sob uma fluorescência habilitado estereomicroscópio)
5. Lavar as cutículas larval 2-3 vezes com peixe fresco e gelado PBS e, finalmente, ressuspender-los em 500 mL de doce gelada PBS, contendo BSA 1%.
6. Para evitar a cutícula larval adere à superfície de vidro do moedor 2 ml Kontes tecido e um pilão grande folga, revestimento de pré-o moedor de tecido e com um pilão BSA 1% em solução PBS e depois de um breve lavar descartar a solução BSA. Posteriormente, usando um fogo-polido Pasteur pipeta, transferir as cutículas do passo 5.5 para o moedor de tecido revestido BSA. [Passo Critical: Pré-cool moedor do tecido / pilão, colocando-o no gelo por alguns minutos para evitar danos às células / lise].
7. Dounce o tecido com pinceladas lenta e constante, evitando a formação de espuma (aproximadamente 20-30 AVC). [Passo Crítico:. Dounce lenta e progressivamente, caso contrário, as células podem lisar]
8. Para avaliar os níveis de células dissociação, limpe a parede externa do moedor de tecido com um tecido Kimwipe limpa, e inspecione-a sob um fluorescentes estereomicroscópio. Os neurônios deveria ter separado da cutícula, e pode ser visto na solução. Se este for encontrado para ser difícil, alternativamente pipeta uma pequena amostra da solução, e observá-la sob um fluorescentes estereomicroscópio. Uma boa indicação de célula de dissociação é a ausência de neurônios a partir da cutícula larval. No entanto, se um ainda observa os neurônios ligados à cutícula, ou observa células incompletamente dissociados, Dounce ainda mais até que as células alcançar uma suspensão única célula.
9. Triturar a solução 5 vezes com um fogo-polido pipeta Pasteur reduzido para aproximadamente 50% do diâmetro da ponta standard, seguido por 10 vezes, com um fogo-polido pipeta Pasteur reduzido para aproximadamente 25% do diâmetro da ponta padrão. [Passo Crítico: trituração Forceful pode danificar as células. Monitorar as células entre as etapas, e ajustar o procedimento de acordo].
10. Filtrar a solução através de um filtro de células 30 mm e recolher o filtrado de células em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml. A solução resultante deve consistir de uma única célula de suspensão e está agora pronto para separação de células magnéticas.

6. Separação de células magnéticas Bead: (45 - 75 minutos, dependendo do tempo de incubação de anticorpos)

1. Adicionar 15 mL de anticorpo esferas magnéticas revestidas a 500 mL de suspensão de células (passo 5.10). Os restantes anticorpo conjugado esferas magnéticas podem ser armazenados até ser necessário para isolamentos de células subseqüentes.
2. Incubar as células com o anticorpo esferas magnéticas revestidas por 30-60 minutos em gelo, com ocasionais hand-mistura. [Passo Crítico: Incubação a uma temperatura mais alta ou mais tempo pode resultar em ligação não específica de anticorpos.]
3. Coloque o tubo de microcentrífuga em um campo magnético forte por 2 minutos. Todas as células positivamente selecionado junto com miçangas unbound vai separar para o lado do tubo.
4. Pipeta lentamente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular.
5. Lave as células 3-4 vezes em fresco, gelada PBS para remover qualquer remanescentes não-específicos de células.
6. Ressuspender as células em 30 mL de fresco, gelada PBS.
7. Para a pureza e rendimento aproximado de células, pipetas mL 5 da susp celularension na superfície polida de um hemocitômetro e contar todas as células visíveis fluorescente sob a fluorescente estereomicroscópio. Também verificar a quantidade de células não-fluorescentes e todos os sinais de impurezas. Tipicamente, a amostra será altamente enriquecido para as células fluorescentes.

7. Isolamento de RNA Bead Magnética Células Ordenado: (60 - 75 minutos)

1. Após a contagem, agregar as células em um campo magnético, desprezar o sobrenadante e adicionar 20 mL de tampão de extração do RNA ™ PicoPure Isolation Kit (dispositivos Molecular). Dependendo do número de células pode-se necessário acrescentar um maior volume de tampão de extração.
2. Vortex do tubo a uma velocidade máxima de permitir a mistura de pellet celular com tampão de extracção.
3. Incubar o tubo a 42 ° C por 30 minutos.
4. Para assegurar a remoção das esferas magnéticas antes da purificação da coluna do RNA (veja o passo 7.5), o tubo é centrifugado brevemente em 2000 (x) g por 2 minutos para agregar as esferas magnéticas. O tubo é então colocado em um campo magnético forte para manter o sedimento, eo sobrenadante é transferido para um tubo de microcentrífuga novo.
5. Extrair e purificar o RNA coluna de acordo com as instruções do fabricante PicoPure RNA kit de extração. Tratamento DNAse é opcional, e pode ser realizada na coluna durante a purificação RNA de acordo com a exigência de análise. Finalmente, eluir o RNA ligado total em um volume pequeno (11-30 mL) de tampão de eluição e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. Se desejar uma alíquota de 1 ml pode ser usado para avaliar a qualidade do RNA total em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Resultados representativos:

Classificação grânulo magnético foi usado para isolar Drosophila da neurônios (Figura 1). O RNA purificado destas neurônios isolados da (Figura 2a) foi encontrado para ser de excelente qualidade, como indicado pela presença de 5.8S afiada, 18S e 28S ribossomal RNA picos quando analisado em um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). Começando com 30-40 larvas de terceiro estádio fomos capazes de isolar em média 300-500 neurônios classe IV da usando o driver ppk-GAL4 e 1500-2000 neurônios da (Classe I, II, III e IV), utilizando o pan- da neurônio-específica GAL4 ^21-7 driver. Para avaliar o enriquecimento neuronal específico de nossas células isoladas foi realizada quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR) usando dois genes específicos neuronal marcadores (elav e futsch). Essas análises revelaram enriquecimento vezes significativo de genes tanto marcador indicando um enriquecimento altamente específico para neurônios da em relação ao fluxo através da utilização de nosso protocolo (Figura 3). Finalmente, o RNA isolado de ambos os pan-da neurônios e os neurônios de classe IV da era usado para realizar perfil de expressão transcricional em Drosophila melanogaster microarrays Agilent todo o genoma oligo (4 x 44K) (Figura 4). Estas análises identificaram numerosas reguladores previamente implicado da morfogênese da dendrito do neurônio, além de um amplo espectro de moléculas já descaracterizados e vias de sinalização de transdução de putativos que desempenham importantes papéis funcionais no desenvolvimento da neurônio. Estudos destinados a avaliar o papel potencial (s) destas moléculas anteriormente descaracterizados na mediação da desenvolvimento dos neurônios, e morfogênese especificamente dendrite, estão atualmente em andamento.

Figura 1:. Esquemática da classificação grânulo magnético dos neurônios da Drosophila (a) Idade combinado larvas de terceiro estádio que ostenta a da neurônio-específica GAL4, UAS-mCD8-GFP repórter transgene são dissecados, invertendo a cutícula larval de dentro para fora, para expor o PNS à dissociação buffer e conservado em gelo frio PBS. (b) dissociação enzimática é realizada através da adição Liberase Blendzyme 3 para a solução contendo cutícula larval. (c) Os tecidos larval são mais dissociadas por uma combinação de trituração vórtex e douncing para retirar não-tecidos especificamente rotulados como fat-corpos intestino, e do SNC. (d, e) As células são, então, filtrada usando um filtro de células 30 mM. A solução contém uma suspensão de células individuais de diferentes tipos celulares, incluindo epitélio musculares e neurônios. (F) Anti-rato CD8a anticorpos revestido Dynabeads M-280 são adicionados à suspensão celular, e incubado em gelo por 30-60 minutos. ( g) As esferas magnéticas se liga aos neurônios da que estão expressando um rato CD8 tag proteína de fusão GFP. (h, i) O grânulo magnético revestido células são separadas por colocar a solução em um forte campo magnético. O sobrenadante é descartado, e as células são lavadas três vezes para remover qualquer resíduo não-específicos de células, resultando em (j) highly purificada populações de neurônios da. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.

Figura 2: (a) Representante da imagem positivamente selecionado, GFP fluorescente neurônios classe IV da célula isolada por dissociação e classificação grânulo magnético. A população de neurônios, resultando estava determinado a ser altamente enriquecido para os neurônios de classe IV da com pouca ou nenhuma célula de impurezas contaminantes. (B) Um Agilent 2100 Bioanalyzer electroferograma (Agilent Technologies, Inc.) de RNA total isolado de grânulo magnético neurônios classificadas da , mostrando uma excelente qualidade de RNA total, como indicado pela presença de 5.8S, 18S, 28S e rRNAs. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Figura 3: qRT-PCR análise de expressão gênica em marcador neuronal isolada da neurônios (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) eo fluxo através de fração foi realizado em triplicata. Os níveis de expressão dos dois genes neuronal específica marcador (elav e futsch) foram avaliados por qRT-PCR. Valores obtidos a partir dessas análises foram normalizados para o controle endógeno (rp49), e os níveis relativos aos observados no fluxo através fração foram calculados usando o método ΔΔCτ ^6. Ambos elav e futsch foram significativamente enriquecido no isolado da população de neurônios, em comparação com o fluxo através de fração.

Figura 4: Representante de classe IV da Cy3 neurônio-específica rotulados microarray arquivo de imagem. Mostrada aqui é um Agilent Drosophila melanogaster todo o genoma oligo microarray (4 x 44K) hibridizados com Cy3-labeld RNA total isolado de neurônios de classe IV da classificação purificado por grânulo magnético. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 4.

Discussion

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o isolamento e purificação de neurônios periféricos que aderem firmemente à superfície interna do estádio terceiro Drosophila cutícula larval usando uma estratégia de triagem magnética talão celular. Embora tenhamos utilizado este protocolo especificamente para isolar neurônios da Drosophila, aplicações deste protocolo para o isolamento de outros tipos de células que se aderem à cutícula larval ou na fase de pupa de desenvolvimento (por exemplo, epitélios, muscular, outros neurônios periféricos) podem ser adaptados por variando alguns parâmetros e usando GAL4 distintas, transgenes UAS-mCD8-GFP repórter que rotular o tipo de célula ou tipos de interesse. Além disso, este protocolo pode ser usado tanto em perda de função e de ganho de função abordagens onde um gene de interesse pode ser clonado em um transgene UAS-mCD8-GFP, que pode ser acoplado com um transgene GAL4 para dirigir ou gene- específicos de perda de função (por exemplo, UAS-RNAi) ou ganho de função para um tipo de célula de interesse. Por exemplo, no caso de um fator de transcrição pode-se desejar identificar genes potencialmente cima ou para baixo-regulado em cima de perda de função ou de ganho de função-expressão em um tipo de célula de interesse. Ao isolar RNA total a partir do tipo de célula purificada de interesse através deste protocolo e utilizando este RNA para realizar perfil de expressão microarray é possível identificar genes diferencialmente regulados que podem representar alvos a jusante de regulação da transcrição que desempenham um papel na mediação alterações fenotípicas dentro da célula .

Para separação de células de sucesso é essencial dar atenção especial aos passos críticos destacados no protocolo acima. Exemplos de áreas de problema comum que pode exigir alguma solução de problemas e otimização, dependendo do tipo celular, incluem (1) baixa e rendimento celular (2) durante o isolamento de células clumping grânulo magnético. No primeiro caso, pode-se tentar reduzir a concentração de Liberase Blendzyme 3, e compensar aumentando a dissociação mecânica via douncing. No segundo caso, pode-se tentar reduzir a intensidade do campo magnético pela aplicação de uma camada única ou múltipla de fita adesiva de laboratório sobre o ímã.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	MP Biomedicals	PBS10X02	Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3	Roche Group	11814176001	Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY	Sigma-Aldrich	83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody	Invitrogen	MCD0815	100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V	GIBCO, by Life Technologies	11018-017	Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11205D	1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit	Molecular Devices	KIT0204	Follow manufacturer’s instructions
Equipment (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used. Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002) Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407) 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004) Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20) Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08) Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g) Vortex Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)