Biology

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

تفاصيل هذا البروتوكول اشتقاق زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) ، والحقن في وقت لاحق في الفئران المتلقي المشع القاتلة. باختصار ، كانت متباينة ESC كهيئات مضغي الشكل ، والذي يصاب بعد ذلك مع HoxB4 فيروسات وشارك في تربيتها مع OP9 الخلايا اللحمية والسيتوكينات المكونة للدم.

Abstract

وتعرف الخلايا الجذعية في زنزانة مع القدرة على تجديد الذات على حد سواء ، وتوليد سلالة مختلفة متعددة. يتم اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) من الكيسة الجنين في وقت مبكر والمحفزة في قدرة differentiative. جعلت إمكاناتها differentiative العظمى منهم تركيز الكثير من الأبحاث تركز على استنتاج كيفية اقناعهم لتوليد أنواع الخلايا مفيدة سريريا. وقد تم مؤخرا بنجاح اشتقاق الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) من الماوس ESC المنجز ويمكن تصور هذا البروتوكول في الفيديو. وتستخدم HSC ، يمكن القول إن سكان الخلية الأكثر استغلالا سريريا ، لعلاج عدد لا يحصى من الأمراض الخبيثة للدم واضطرابات. ومع ذلك ، العديد من المرضى التي قد تستفيد من العلاج HSC عدم الوصول إلى الجهات المانحة المناسبة. يمكن ESC توفير مصدر بديل للشهادة الثانوية العامة لهؤلاء المرضى. بروتوكول التالية تضع الأساس الذي يمكن من خلاله درس ESC - HSC وإعلام جهودا لعزل HSC من ESC الإنسان. في هذا البروتوكول ، ويتم التمييز ESC كهيئات مضغي الشكل (EBS) لمدة 6 أيام في المتاحة تجاريا تمايز الأمثل المصل بعد فرزهم للدم. EBS يتم فصلها ثم المصابين HoxB4 فيروسات. ومطلي المصابة EB - مشتقة الخلايا على OP9 سدى ، وهو خط نخاع العظم الخلايا المشتقة من انسجة من calvaria / - M - CSF -- الفئران ، وشارك في تربيتها في حضور تعزيز السيتوكينات تكون الدم لمدة عشرة أيام. خلال هذه الثقافة المشتركة ، وتوسيع الخلايا المصابة بشكل كبير ، مما أدى إلى توليد مجموعة غير متجانسة من 100s من الملايين من الخلايا. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها لانقاذ الفئران وإعادة المشع القاتلة.

Protocol

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية

جمع قارورة متكدسة بالقرب من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) عن طريق العلاج مع التربسين ESC.
Resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام ونقل التمايز إلى T25 الجيلاتين غير المغلفة. احتضان في 37 لمدة 45 دقائق درجة مئوية. استرداد طاف وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

ملاحظة : الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFs) من الثقافات ESC نعلق بسهولة إلى T25 غير المغلفة الجيلاتين ، وبالتالي فهي تقلص من الثقافة خلال هذه الخطوة الطلاء. إذا كنت لا استزراع ESC الخاص بك على MEFs ، يمكنك تخطي لوحة مسبقة.
Resuspend MEF - ESC المنضب في وسائل الإعلام في التفريق مل cells/50 333333. هذا التركيز في نتائج مل ESC/15 100.
استخدام متعدد القنوات pipettor ، لوحة ESC في 100 مل قطرة cells/15 على لوحات بتري 15 سم ^2. مع pipettor 8 قنوات ، يجب أن تكون قادرة على احتواء حوالي 18-22 الصفوف من قطرات في لوحة (حوالي 5ml لكل لوحة).

ملاحظة : للحصول على هذا البروتوكول ، 2-5 سم ² 15 الاطباق قطرات ستكون أكثر من كافية ، وينبغي أن تسفر 2-5 × 10 ⁶ ستة أيام EB الخلايا المشتقة.
الوجه بلطف لوحات لعكس قطرات. احتضان في 37 ° C CO ₂ 5 ٪ لمدة 48 ساعة.
تجمع قطرات بلطف بواسطة دوامات لوحات ونقل إلى أنبوب 15 مل المخروطية. شطف مع لوحات 4-6 مل من برنامج تلفزيوني ، ويضاف إلى نفسه المخروطية 15 مليلتر.

ملاحظة : قد تجمع ما يصل الى خمس لوحات قطرة شنقا. سوف تنمو EBS لأنها لا تزال تفرق واذا كانت تتركز أيضا أنها تميل إلى تشكيل كتل كبيرة.
تسمح EBS مجمعة لتسوية عن طريق الجاذبية (حوالي 10 دقيقة). نضح طاف دون إزعاج EBS. resuspend بلطف وسائل الاعلام في 10 مل من التمايز ونقل إلى 10 سم طبق بتري غير ملتصقة.
مكان بتري على لوحة لوحة شاكر في 50 دورة في الدقيقة و 37 درجة في احتضان ثاني C 5 ٪ _2.
بعد 24 ساعة (أربعة أيام من تمايز) ، لوحات دوامة التركيز الحديدية في وسط طبق بتري. بعناية تبادل 50 ٪ من وسائل الإعلام (5 مل) مع 5 مل الإعلام التمايز الطازجة. عودة إلى لوحة حاضنة لمدة يومين آخرين.

EB تفارق وعدوى MSCV - HoxB4 - IRES - GFP

في اليوم السادس من التمايز ، ونقل إلى أنبوب EBS 15 مليلتر المخروطية. السماح لتسوية عن طريق الجاذبية.
نضح في وسائل الإعلام وresuspend PBS 10 مل. EBS تسمح لإعادة توطين بواسطة الجاذبية. نضح برنامج تلفزيوني.
إضافة 250 مل من مزيج انزيم تفارق PBS و 1 مل. احتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 20 دقيقة ، وأحيانا يحوم أنبوب لخلط الأنزيمات وEBS.
إضافة 8 مل تفارق عازلة خالية من الانزيم.
متمزج الخليط باستخدام ماصة 5 مل حتى يتم فصلها تماما EBS (حوالي 10 مرة ؛ pipetting المفرط ستزيد الموت داخل EB - مشتقة إعداد الخلية).
1. وسوف يصبح غائما مع خليط الخلايا كما تنأى EBS.
2. وسوف يضع طرف ضد ماصة أسفل أنبوب مخروطي سحن خلال إنشاء قوة القص الذي سيسهل كثيرا التفكك.
جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend EB الخلايا المشتقة في 5 مل من IMDM 10 ٪ وعدد استبعاد استخدام التريبان الأزرق

ملاحظة : بين يوم وأربعة وستة أيام من التمايز ، EBS التجويف الذي ينتج كمية كبيرة من الخلايا والخلايا death.Thus ، في ستة أيام ، ما يزيد عن 30 ٪ من الخلايا المشتقة EB قد صمة عار مع الأزرق التريبان.
Resuspend الخلايا المشتقة في EB - 100000 خلية / 2 مل من 10 ٪ + IMDM الفيروسية مثل طاف هو أن وزارة الداخلية من 5-10 achieved.Add سلفات بروتامين إلى تركيز النهائي من 8 ملغ / مل.

ملاحظة : إعداد ما يكفي EB / مزيج طاف الفيروسية لوحة أربع صفائح 6 - جيدا (على افتراض 2 مل / جيد).
لوحة EB 2 مل / مزيج طاف الفيروسية لكل بئر من أربع لوحات 6 جيدا قبل مطلي مع الخلايا سدى OP9 (أنظر أدناه).
ألواح الطرد المركزي في 2500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. لوحات نقل الحاضنة 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO _2.
4-6 ساعات في وقت لاحق ، والحصاد طاف من لوحات وجمع أي الخلايا المتبقية المحتملة في التعليق عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend بيليه (قد تكون صغيرة) في IMDM مل 48 10 ٪ + السيتوكينات. الاستغناء 2 مل / جيدا لإعادة تعليق لوحات أصلية 6 - جيدا الأربعة التي أجريت العدوى وجمعت طاف.

ملاحظة : تعد دائما 10 ٪ + IMDM السيتوكينات الطازجة في وقت الاستخدام.
احتضان لوحات في 37 ° C CO ₂ 5 ٪ لمدة سبعة أيام. وينبغي أن يكون واضحا المستعمرات يوم آخر عن طريق العدوى الأربعة وكبيرة وبشكل جيد من قبل سبعة ايام. وينبغي أن يكون التوسع القوي العائد 40-60 المستعمرات / جيد على سبعة ايام.
على سبعة ايام عدوى آخر ، وجمع وتجمع كافة الخلايا (بما في ذلك OP9 سدى) من جميع الآبار التي المعاملة مع التربسين.

ملاحظة : لا تجاهل طاف أو توظيفهم خلال برنامج تلفزيوني يغسل treatment.At التربسين هذه النقطة في الثقافة ، وبعض المستعمرات قد تكون ملتصقة فقط فضفاضة ، وهناك العديد من الخلايا floaتينغ في suspension.Collect وحمام سباحة وطاف يغسل كل لضمان أن يتم تجاهل وجود خلايا ذات قيمة عالية.
Resuspend خلايا جديدة في 8 IMDM مل + 10 ٪ السيتوكينات. توزيع تراخيص 2 / القارورة في قوارير T75 الأربعة. إضافة تراخيص إضافية 13 + 10 ٪ IMDM السيتوكينات إلى كل القارورة. احتضان عند 37 درجة مئوية 5 ٪ CO ₂ لمدة ثلاثة أيام (أي ما مجموعه عشرة إصابة آخر أيام).

الثقافة وتصفيح سدى OP9

الحفاظ على OP9 سدى وفقا لبروتوكولات قياسية في 20 ٪ ، MEM. وسوف تغيير خصائص الخلايا OP9 عندما نما إلى confluency. انقسام دائما بنسبة 80 ٪ في confluency لا يزيد 01:03 الانقسام.
قبل 24 ساعة من العدوى من الخلايا المشتقة من يوم EB ستة مع MSCV - HoxB4 - IRES - GFP ، لوحة الخلايا OP9 25000 / أربعة جيدا جيدا 6 لوحات في 20 ٪ MEM.

جمع والتجزيء والزرع

جمع الخلايا الموسع بشأن OP9 سدى لمدة عشرة أيام عن طريق العلاج مع التربسين. عدد الخلايا.

يغسل المستعملة لا تجاهل طاف أو برنامج تلفزيوني أثناء العلاج التربسين : مذكرة. عند هذه النقطة في الثقافة ، وبعض المستعمرات قد تكون ملتصقة فقط فضفاضة ، وهناك العديد من الخلايا تطفو في suspension.Collect وحمام سباحة وطاف يغسل كل لضمان أن يتم تجاهل وجود خلايا ذات قيمة عالية.

ملاحظة : يجب أن توسع جيدة العائد بين 4-50 خلايا س ⁶ 10 / 6 الأصلية ، كذلك لوحة المصابة ، ليصبح المجموع 160-200 س ⁶ 10 الخلايا.
قد تكون مجزأة الخلايا عبر اختيار حبة المغناطيسي أو وفقا لنظام مراقبة الأصول الميدانية التقنيات القياسية في هذه النقطة في البروتوكول.
للزرع ، وتقديم الخلايا عبر المدار الرجعية أو الذيل حقن الوريد إلى المستلمين ناقصة Rag-2/gc (وزنها بين 15-22 جرام) تعرض لجرعة انقسام 9.25 غراي من 2.5 ساعة التشعيع. وبصرف النظر.

ملاحظة : من المهم جدا أن وزن الحيوانات تقع بين 15-22 غراما في وقت التشعيع. إذا كانت أكبر من 22 غراما ، وسوف لا يكون 9.25 غراي جرعة كافية من التشعيع لضمان الاجتثاث المناسبة والخلايا قد لا توسط الانقاذ من الإشعاع المميتة و / أو تدبر المقصورة للدم. إذا زرع الحيوانات الكبيرة ، يجب تحديد الجرعة المناسبة تشعيع تجريبيا.
مطلوب جرعة الحد الأدنى من 2-5 خلايا ^{6 ×} 10 / الحيوانية لضمان انقاذ من الإشعاع القاتل. إذا تجزئة الخلايا ، وضخ 2-5 × 10 ⁶ خلية حكمه (على سبيل المثال إذا كان السكان من الاهتمام تمثل 10 ٪ من تجمع الخلايا غير المجزأ ، وضخ 2-5 × 10 ⁵ خلية / الحيوان).

ملاحظة : إذا كان عن طريق الحقن> 2 × 10 ⁶ خلايا ، وضخ دائما عن طريق الوريد لتجنب تشكيل ذيل مسخي في المدار ، مما قد يؤدي عندما يتم تسليم أعداد كبيرة من الخلايا orbitally الرجعية.
الحفاظ على خرقة - 2 ^{-- / --} / GC ^{-- / --} متلقي قاصرة في أقفاص تعقيمها. اعتمادا على "نظافة" للمنشأة حيوانية ، قد زرع في مرحلة ما بعد حيوانات تتطلب ادارة المياه المحمضة أو Trimethiprim Sulfasoxazole - (Septra) في الأسابيع التالية 5 الإشعاع المميتة.
نتوقع> GFP 90 ٪ + ES - مشتقة الكريات البيض في الدم المحيطي في 3 أسابيع بعد الزرع. وينبغي أن تكون متعددة Engraftment النسب ، وإن كان من المعروف أن الخلايا الليمفاوية الصمت فيروسات HoxB4 - IRES - GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc