Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Abstract

Eine Stammzelle ist eine Zelle mit der Fähigkeit, definiert sowohl selbst erneuern und erzeugen mehrere differenzierte Nachkommenschaft. Embryonale Stammzellen (ESC) werden aus der Blastozyste des frühen Embryos abgeleitet und sind in differenzierenden Fähigkeit pluripotent. Ihre große Differenzierungspotential hat sie im Mittelpunkt der Forschung am abzuleiten, wie man sie überreden, um klinisch nützliche Zelltypen erzeugen zentriert. Die erfolgreiche Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) aus Maus ESC wurde kürzlich durchgeführt und kann in diesem Video-Protokoll visualisiert werden. HSC, die wohl klinisch genutzt Zellpopulation, werden verwendet, um eine Vielzahl von hämatopoetischen Malignomen und Störungen zu behandeln. Allerdings mangelt es vielen Patienten, die von HSC-Therapie profitieren könnten den Zugang zu geeigneten Spendern. ESC könnte eine alternative Quelle von HSC für diese Patienten. Das folgende Protokoll stellt eine Grundlinie, aus dem ESC-HSC studiert und kann zu informieren Anstrengungen zur HSC aus menschlichem ESC zu isolieren. In diesem Protokoll werden ESC als Embryoidkörpern (EVG) für 6 Tage in kommerziell erhältlichen Serum sorgfältig geprüften optimale hämatopoetische Differenzierung unterschieden. EBs werden dann dissoziiert und infiziert mit retroviralen HOXB4. Mäuse und Co-Kultivierung in Gegenwart von Hämatopoese Zytokine für 10 Tage - Infected EB-abgeleiteten Zellen sind auf OP9 Stroma, eine Knochenmark-Zelllinie, die aus der Schädeldecke des M-CSF-/ abgeleitet überzogen. Während dieser Co-Kultur, die infizierten Zellen stark zu erweitern, was in der Erzeugung einer heterogenen Pool von 100s von Millionen von Zellen. Diese Zellen können dann zu retten und zu rekonstruieren letal bestrahlten Mäusen verwendet werden.

Protocol

Differenzierung von embryonalen Stammzellen

1. Sammle in der Nähe konfluenten Flasche von embryonalen Stammzellen (ESC) über die Behandlung mit ESC Trypsin.
2. Die Zellen in 5 ml Differenzierung Medien und Übertragung auf einen Nicht-Gelatine beschichteten T25. Bei 37 ° C für 45 Minuten. Abrufen Überstand sammeln und Zellen über Zentrifugation.
   
   Hinweis: Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) aus dem ESC Kulturen legen leicht zu den Nicht-Gelatine beschichteten T25 und damit aus der Kultur während dieser Beschichtung Schritt erschöpft. Wenn Sie nicht Ihre Kultivierung ESC auf MEFs sind, können Sie überspringen die pre-Platte.
   
   
3. Resuspendieren MEF-abgereicherten ESC in Abgrenzung Medien bei 333.333 Zellen/50 mL. Diese Konzentration führt in 100 mL ESC/15.
4. Einsatz von Multi-Kanal-Pipette, Platte ESC bei 100 cells/15 mL Tropfen auf 15 cm ² Petrischalen. Mit einer 8-Kanal Pipette, sollte es möglich sein, über 18-22 Reihen von Tropfen pro Platte (ca. 5 ml pro Platte) passen.
   
   Hinweis: Für dieses Protokoll, 2-5 15 cm ² Gerichte der Tropfen wird mehr als ausreichend und sollte 2-5 x 10 ⁶ Tag sechs EB-abgeleiteten Zellen zu erhalten.
   
   
5. Gently Flip Platten Tropfen umzukehren. Bei 37 ° C 5% CO ₂ für 48 Stunden.
6. Pool fällt durch vorsichtiges Schwenken Platten und Transfer bis 15 mL konischen Rohr. Spülen Platten mit 4-6 ml PBS und fügen gleichzeitig 15 mL konisch.
   
   Hinweis: Sie können Pools bis zu fünf hängenden Tropfen Platten. Die EBs wird wachsen, da sie zu differenzieren und weiter, wenn sie zu konzentriert sind sie neigen dazu, große Klumpen bilden.
   
   
7. Lassen Sie gebündelt EBs durch die Schwerkraft (ca. 10 Minuten) zu begleichen. Saugen Sie den Überstand ohne störende EBs. Vorsichtig in 10 mL Differenzierung Medien und Transfer bis 10 cm nicht haftende Petrischale resuspendieren.
8. Legen Sie Petrischale auf einem Schüttler bei 50 rpm und bei 37 ° C 5% CO _2.
9. 24 Stunden später (Tag vier der Differenzierung), zu wirbeln Platten EBs in der Mitte der Petrischale zu konzentrieren. Sorgfältig Austausch 50% der Medien (5 ml) mit 5 ml frisch Differenzierung Media. Zurück Platte Inkubator für zwei weitere Tage.

EB Dissoziation und Infektion mit MSCV-HOXB4-IRES-GFP

1. Am sechsten Tag der Differenzierung, der Transfer EBs bis 15 mL konischen Rohr. Lassen Sie die durch die Schwerkraft zu begleichen.
2. Absaugen Medien und resuspendieren in 10 ml PBS. Lassen EBs durch die Schwerkraft anzusiedeln. Absaugen PBS.
3. Add 250 ml Dissoziation Enzym-Mix und 1 ml PBS. Inkubieren in 37 ° C Wasserbad für 20 Minuten, gelegentlich wirbelnden Rohr Enzyme und EBs mischen.
4. 8 ml Enzym-free Dissoziationspuffer.
5. Man reibt Mischung mit 5 ml Pipette bis EBs vollständig dissoziiert sind (etwa 10-mal, übermäßiges Pipettieren wird der Tod innerhalb der EB-derived Zellpräparation erhöhen).
   1. Mischung wird trüb mit Zellen als EBs distanzieren.
   2. Platzieren Pipettenspitze gegen Ende des konischen Rohres während Verreibung wird eine Querkraft, die erheblich erleichtern wird Dissoziation.
6. Sammeln Zellen über Zentrifugation.
7. Die Zellen in 5 ml 10% IMDM EB-derived und zählen mit Trypanblau-Ausschluss
   
   Hinweis: Zwischen Tag vier und Tag sechs der Differenzierung, der EBs kavitieren die Ergebnisse in einer großen Menge von Apoptose und Zell death.Thus am sechsten Tag, nach oben von 30% des EB-abgeleiteten Zellen können mit Trypanblau gefärbt.
   
   
8. Resuspendieren EB-abgeleiteten Zellen bei 100.000 Zellen / 2 ml 10% IMDM + virale Überstand, so dass eine MOI von 5-10 ist Protaminsulfat, um eine endgültige Konzentration von 8 mg / mL achieved.Add.
   
   Hinweis: Bereiten Sie genug EB / virale Überstand Mix-to-Plate vier 6-Well-Platten (vorausgesetzt, 2 ml / well).
   
   
9. Plate 2 mL EB / virale Überstand Mischung pro Vertiefung vier 6-Well-Platten vor vergoldet mit OP9 Stromazellen (siehe unten).
10. Centrifuge Platten bei 2500 rpm bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Transfer-Platten bei 37 ° C 5% CO _2.
11. 4-6 Stunden später Ernte Überstand aus Platten sammeln und mögliche verbleibenden Zellen in Suspension durch Zentrifugation.
12. Pellet (mag klein sein) in 48 mL 10% IMDM + Zytokine. Dispense 2 mL / Vertiefung Resuspension zur ursprünglichen vier 6-Well-Platten, in denen Infektionen durchgeführt und war Überstand wurde gesammelt.
    
    Hinweis: Immer vorbereiten 10% IMDM + Zytokine frisch zum Zeitpunkt der Nutzung.
    
    
13. Die Platten bei 37 ° C 5% CO ₂ für sieben Tage. Kolonien sollten durch Tag vier nach der Infektion und groß und von Tag sieben wohlgeformt erkennbar. Eine robuste Expansion sollte 40-60 Kolonien / well am siebten Tag erhalten.
14. Am Tag sieben nach der Infektion, zu sammeln und Pool alle Zellen (einschließlich OP9 Stroma) aus allen Vertiefungen durch Behandlung mit Trypsin.
    
    Hinweis: NICHT Überstand verwerfen oder PBS Waschungen während Trypsin treatment.At dieser Stelle in die Kultur eingesetzt wird, kann einige Kolonien werden nur lose anhaftenden und es gibt viele Zellen schwimting in suspension.Collect und Pool alle wäscht und Überstand, um sicherzustellen, dass keine potentiell wertvolle Zellen verworfen werden.
    
    
15. Die Zellen in 8 ml frisches 10% IMDM + Zytokine. Verteilen Sie 2 ml / Kolben in vier T75-Kolben. Hinzufügen eines zusätzlichen 13 ml 10% IMDM + Zytokine zu jeder Flasche. Bei 37 ° C 5% CO ₂ für 3 Tage (insgesamt 10 Tage nach der Infektion).

Kultur und Beschichtung von OP9 Stroma

1. Pflegen Sie OP9 Stroma nach Standardprotokollen in 20% a-MEM. OP9 Zellen Eigenschaften ändern, wenn bis zur Konfluenz gewachsen. Immer bei 80% Konfluenz bei nicht mehr als 1:3 Split.
2. 24 Stunden vor der Infektion von Tag sechs EB-abgeleiteten Zellen mit MSCV-HOXB4-IRES-GFP, Platte 25.000 OP9 Zellen / Well von vier 6-well Platten in 20% a-MEM.

Collection, Fraktionierung und Transplantation

1. Sammeln Zellen auf OP9 Stroma für 10 Tage durch die Behandlung mit Trypsin erweitert. Zählen von Zellen.
   
   Hinweis: NICHT Überstand verwerfen oder PBS Waschungen während Trypsin-Behandlung eingesetzt werden. An diesem Punkt in der Kultur, können einige Kolonien werden nur lose anhaftenden und es gibt viele schwimmende Zellen in suspension.Collect und Pool alle wäscht und Überstand, um sicherzustellen, dass keine potentiell wertvolle Zellen verworfen werden.
   
   Hinweis: Eine gute Erweiterung sollte zwischen 40-50 x 10 ⁶ Zellen / original 6-Well-Platte infiziert ergeben, insgesamt von 160-200 x 10 ⁶ Zellen.
   
   
2. Zellen können fraktioniert werden über Magnetic-Bead-Auswahl oder FACS nach Standardverfahren an dieser Stelle in das Protokoll.
3. Für die Transplantation, liefern Zellen über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektion Rag-2/gc mangelhaft Empfänger (mit einem Gewicht zwischen 15-22 Gramm) unterzogen, um eine Spaltung Dosis von 9,25 Gy Bestrahlung 2,5 Stunden. auseinander.
   
   Hinweis: Es ist wichtig, dass das Gewicht der Tiere zwischen 15-22 Gramm zum Zeitpunkt der Bestrahlung fallen. Wenn sie größer als 22 Gramm sind, werden 9,25 Gy nicht eine ausreichende Dosis der Bestrahlung werden die entsprechenden Ablation sicher und Zellen können nicht vermitteln Rettung aus tödlicher Bestrahlung und / oder einprägen des blutbildenden Fach. Wenn die Transplantation größerer Tiere, müssen die entsprechenden Bestrahlungsdosis experimentell bestimmt werden.
   
   
4. Eine minimale Dosis von 2-5 x 10 ⁶ Zellen / Tier ist erforderlich, um Rettung aus tödlicher Bestrahlung zu gewährleisten. Wenn Fraktionierung Zellen injizieren 2-5 x 10 ⁶ Zellen-Äquivalente (zB wenn der Bevölkerung von Interesse 10% der mit unfraktioniertem Pool von Zellen darstellt, spritzen 2-5 x 10 ⁵ Zellen / Tier).
   
   Hinweis: Sollte das Spritzen> 2 x 10 ⁶ Zellen, immer über Schwanzvene zu injizieren, um Teratom-Bildung in der Umlaufbahn, die entstehen, wenn eine hohe Zahl von Zellen retroorbital geliefert werden können, zu vermeiden.
   
   
5. Pflegen Sie Rag-2 ^{- / -} / gc ^{- / -} defizienten Empfängern in autoklaviert Käfigen. Abhängig von der "Sauberkeit" des Tieres Anlage kann nach der Transplantation Tiere Verwaltung von angesäuertem Wasser oder Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) für die 5 Wochen nach der tödlichen Strahlung benötigen.
   
6. Expect> 90% GFP + ES-derived Leukozyten im peripheren Blut bei 3 Wochen nach der Transplantation. Engraftment sollte multi-lineage, obwohl Lymphozyten bekannt sind, retrovirale HOXB4-IRES-GFP Stille.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc