Biology

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Abstract

Uma célula-tronco é definida como uma célula com capacidade para tanto se auto-renovar e gerar descendência diferenciada múltiplas. Células-tronco embrionárias (ESC) são derivadas do blastocisto do embrião e são pluripotentes na capacidade differentiative. Seu potencial differentiative vasta fez-lhes o foco de muita pesquisa centrada na deduzir como persuadi-los para gerar tipos de células clinicamente útil. A derivação bem-sucedida de células-tronco hematopoiéticas (HSC) de rato ESC foi recentemente realizado e pode ser visualizado neste protocolo de vídeo. HSC, sem dúvida, a população de células clinicamente mais explorados, são usados para tratar uma miríade de malignidades hematopoiéticas e distúrbios. No entanto, muitos pacientes que poderiam se beneficiar da terapia HSC não tem acesso a doadores compatíveis. ESC poderiam fornecer uma fonte alternativa de HSC para estes pacientes. O protocolo a seguir estabelece uma linha de base a partir da qual ESC-HSC podem ser estudados e informar os esforços para isolar HSC da ESC humana. Neste protocolo, ESC são diferenciados como corpos embrióides (EBs) por 6 dias disponíveis comercialmente soro pré-selecionados para a diferenciação ótima hematopoiéticas. EBs são, então, dissociado e infectados com HoxB4 retroviral. Infectados EB células derivadas são semeadas em OP9 estroma, uma linhagem de células de medula óssea estromal derivado da calvária de /-M-CSF - ratos, e co-cultivados na presença de hematopoiese promover citocinas por dez dias. Durante este co-cultura, as células infectadas expandir muito, resultando na geração de uma piscina heterogêneo de 100s de milhões de células. Estas células podem então ser usados para resgatar e reconstituir camundongos letalmente irradiados.

Protocol

Diferenciação de células-tronco embrionárias

Coletar um frasco perto confluentes de células-tronco embrionárias (ESC), através de tratamento com tripsina ESC.
Ressuspender as células em 5 mL de mídia Diferenciação e transferir para um T25 não-revestido de gelatina. Incubar a 37 ° C por 45 minutos. Recuperar o sobrenadante e coletar células através de centrifugação.

Nota: fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) das culturas ESC anexar prontamente aos T25 não-revestido de gelatina e, portanto, estão esgotados a partir da cultura durante esta etapa de galvanização. Se você não é o seu cultivo em MEFs ESC, você pode pular a placa pré-.
Ressuspender MEF-esgotados ESC na mídia Diferenciação em 333.333 mL cells/50. Esta concentração resulta em 100 mL ESC/15.
Usando multi-canal de pipetador, placa ESC a 100 mL cells/15 queda em 15 cm ² placas de petri. Com uma pipeta de 8 canais, você deve ser capaz de caber aproximadamente 18-22 fileiras de gotas por placa (cerca de 5 ml por placa).

Nota: Para este protocolo, 2-5 15 cm ² pratos de gotas será mais do que suficiente e deve render 2-5 x 10 ⁶ de seis dias EB células derivadas.
Suavemente virar placas para inverter gotas. Incubar a 37 ° C 5% CO ₂ por 48 horas.
Piscina cai rodando suavemente placas e transferir para tubo de 15 mL cônico. Enxaguar pratos com 4-6 mL de PBS e adicionar à mesma 15 mL cônico.

Nota: Você pode piscina até cinco placas de gota em suspensão. O EBS vai crescer à medida que continuam a diferenciar e se eles são muito concentrados tendem a formar grumos grandes.
Permitir EBs agrupados para resolver pela força da gravidade (cerca de 10 minutos). Aspirar o sobrenadante sem perturbar EBs. Delicadamente ressuspender em 10 mL de mídia Diferenciação e transferência a 10 cm da placa de petri não-aderente.
Colocar a placa de petri na placa shaker a 50 rpm e incubar a 37 ° C 5% CO _2.
24 horas depois (dia quatro de diferenciação), placas de turbulência para se concentrar EBs no centro da placa de Petri. Cuidadosamente troca de 50% dos meios de comunicação (5 mL) com 5 mL de mídia Diferenciação fresco. Retorno placa para incubadora por mais dois dias.

EB dissociação e infecção com MSCV-HoxB4-IRES-GFP

No dia seis de diferenciação, a transferência de EBs a 15 mL do tubo cônico. Deixa-se repousar por gravidade.
Aspirar mídia e ressuspender em 10 mL PBS. Permitir EBs para reassentar pela gravidade. Aspirar PBS.
Adicionar 250 mL mix enzima dissociação e 1 mL de PBS. Incubar em banho-maria 37 ° C por 20 minutos, ocasionalmente turbilhão tubo para misturar enzimas e EBs.
Adicionar 8 mL da enzima livre de buffer de dissociação.
Triturar a mistura usando pipeta de 5 ml até EBs são totalmente dissociados (cerca de 10 vezes; pipetagem excessiva aumentará a morte dentro do EB derivados preparação celular).
1. Mistura será nublado com células como dissociar EBs.
2. Colocando a ponteira contra a parte inferior do tubo cônico durante a trituração vai criar uma força de cisalhamento que vai facilitar muito a dissociação.
Coletar células através de centrifugação.
Ressuspender EB células derivadas em 5 mL de IMDM 10% e contagem usando trypan exclusão azul

Nota: Entre quatro dias e seis dias de diferenciação, EBs cavitar o que resulta em uma grande quantidade de apoptose e death.Thus celular, no sexto dia, mais de 30% da EB células derivadas pode manchar com azul de tripano.
Ressuspender as células EB-derivados de 100.000 células / 2 mL de 10% IMDM + sobrenadante viral de tal forma que um MOI de 5-10 é achieved.Add sulfato de protamina para uma concentração final de 8 mg / mL.

Nota: Prepare o suficiente EB / mix sobrenadante viral ao prato quatro chapas 6-bem (assumindo que 2 mL / poço).
Placa de 2 mL EB / mix sobrenadante viral por poço de quatro 6 placas bem pré-revestida com OP9 células do estroma (veja abaixo).
Centrífuga placas a 2500 rpm em temperatura ambiente por 90 minutos. Transferência de placas para incubadora a 37 ° C 5% CO _2.
4-6 horas mais tarde, a colheita sobrenadante a partir de chapas e recolher as células potencial remanescente em suspensão através de centrifugação.
Ressuspender pellet (pode ser pequeno) em 48 mL IMDM 10% + citocinas. Dispense 2 mL / poço de ressuspensão de original de quatro bem-6 placas em que a infecção foi realizada e sobrenadante foi coletado.

Nota: Sempre prepare 10% IMDM + citocinas fresco no tempo de uso.
Incubar as placas a 37 ° C 5% CO ₂ por sete dias. Colônias deve ser aparente por dia após a infecção e quatro grandes e bem formado por sete dias. A expansão robusta deve render 40-60 colônias / bem no dia sete.
No sétimo dia pós-infecção, coletar e piscina todas as células (incluindo OP9 estroma) de todos os poços por tratamento com tripsina.

Nota: NÃO descartar sobrenadante ou PBS lava empregados durante tripsina treatment.At neste ponto da cultura, algumas colônias podem ser apenas vagamente aderente e existem muitas células flutuar livrementing em suspension.Collect e piscina todos os lava e sobrenadante para garantir que nenhum células potencialmente valiosos são descartados.
Ressuspender as células em 8 mL IMDM fresca a 10% + citocinas. Distribuir 2 ml / frasco em quatro frascos T75. Adicionar um adicional de 13 mls citocinas + 10% IMDM em cada balão. Incubar a 37 ° C 5% CO ₂ por três dias (um total de dez dias após a infecção).

Cultura e chapeamento de OP9 estroma

Manter OP9 estroma de acordo com protocolos padrão em 20% a-MEM. OP9 células vão alterar as propriedades quando cultivadas a confluência. Sempre dividido em 80% confluência em não mais de 1:03 dividido.
24 horas antes da infecção do dia seis EB células derivadas com MSCV-HoxB4-IRES-GFP, placa OP9 25.000 células / poço de quatro bem-6 placas em 20% ao MEM.

Fracionamento de recolha e transplante

Coletar células expandidas em OP9 estroma de 10 dias através de tratamento com tripsina. Contagem de células.

Nota: NÃO descartar sobrenadante ou PBS lava empregadas durante o tratamento de tripsina. Neste ponto, na cultura, algumas colônias podem ser apenas vagamente aderente e existem muitas células flutuando no suspension.Collect e piscina todos os lava e sobrenadante para garantir que nenhum células potencialmente valiosos são descartados.

Nota: Uma boa expansão deve render entre 40-50 x 10 ⁶ células / placa 6-bem original infectado, para um total de 160-200 x 10 ⁶ células.
Células podem ser fracionados através da selecção do grânulo magnético ou FACS acordo com técnicas padronizadas neste ponto no protocolo.
Para o transplante, as células entregar via retro-orbital ou injeção veia da cauda para Rag-2/gc destinatários deficiente (pesando entre 15-22 gramas) submetido a uma dose fracionada de 9,25 Gy de radiação 2,5 horas. além.

Nota: É importante que o peso dos animais cair entre 15-22 gramas no momento da irradiação. Se eles são maiores do que 22 gramas, 9,25 gy não será uma dose suficiente de radiação para garantir a ablação apropriado e células não podem mediar resgate de irradiação letal e / ou enxertar o compartimento hematopoiético. Se o transplante animais de maior porte, a dose de irradiação adequada deve ser determinada experimentalmente.
A dose mínima de 2-5 x 10 ⁶ células / animal é necessário para garantir resgate de irradiação letal. Se fracionar as células, injetar 2-5 x 10 ⁶ células equivalentes (por exemplo, se a população de interesse representa 10% do pool de células não fracionada, injetar 2-5 x 10 ⁵ células / animal).

Nota: Se injetar> 2 x 10 ⁶ células, SEMPRE injetar via veia da cauda para evitar a formação de teratomas em órbita, o que pode resultar quando os números elevados de células são entregues retro-orbital.
Manter Rag-2 ^{- / -} / gc ^{- / -} destinatários deficiente em gaiolas autoclavado. Dependendo da "limpeza" do estabelecimento animal, pós-transplante animais podem exigir a administração de água acidificada ou Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) para a 5 semanas seguintes de radiação letal.
Esperar> GFP 90% + ES-derivados de leucócitos no sangue periférico em três semanas pós-transplante. Enxerto deve ser multi-linhagem, embora os linfócitos são conhecidos por silêncio retroviral HoxB4-IRES-GFP.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc